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成体干细胞对于维持组织稳态与器官再生至关重要。衰老个体中组织器官的功能破坏与成体干细胞的数量减少及功能降低密切相关。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一类起源于中胚层的成体干细胞,目前研究比较广泛。然而随着个体衰老,体内微环境的改变对干细胞衰老起重要作用。MSCs数量随供体年龄增长而减少,其增殖和存活能力也减弱。体外培养的早代次老年个体MSCs即表现出衰老征象。这是导致老年个体器官功能下降的原因之一,也是制约老年患者自体干细胞移植疗效的主要因素。因此,如何维持或重塑衰老MSCs的生命活力是我们亟待解决的关键问题。微小RNA（micro RNAs,miRNAs）源自基因组的非编码区以及编码区的内含子,主要通过RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ转录而来。miRNAs通过与靶m RNA的互补配对来调节基因的表达,进而参与机体各种复杂的生物学过程。通常单个miRNA能够靶向多个m RNA,多个miRNAs也能够同时调控单个m RNA。作为表观遗传学的重要机制之一,miRNAs对维持细胞稳态及延缓细胞衰老等方面具有重要意义。随着衰老的发生,生物体或组织的总miRNAs表达量呈下降的趋势,这可能与miRNAs所介导的年龄相关的生物学过程有关。从秀丽隐杆线虫到人类,miRNAs能够调控多种生物的衰老过程。这些能够直接参与调控衰老的miRNAs,被称为衰老相关的miRNAs。由此推测:在MSCs衰老过程中,可能也存在一些miRNAs对干细胞衰老起调控作用。那么,在衰老MSCs中哪些miRNAs表达发生了显著变化?这些miRNAs可能具有哪些生物学功能?目前尚不清楚。目的:探讨miRNAs在老龄大鼠MSCs中的表达,并对差异表达miRNAs的靶基因进行功能富集分析以明确其生物学功能,为深入研究干细胞衰老的分子机制以及应用miRNAs作为治疗靶标开发抗衰老的干预策略提供实验依据。方法:本研究以年轻大鼠（1-2月龄）和老龄大鼠（15-18月龄）来源的MSCs为研究对象,首先采用全骨髓贴壁法和体外传代培养法分别获得P3代MSCs（P3MSCs）,然后通过细胞形态学观察、SA-β-gal染色、胞内ROS含量以及衰老相关因子表达的检测评估细胞衰老,进一步对年轻和衰老MSCs进行miRNAs测序（miRNA sequencing,miRNA-seq）,明确MSCs衰老过程中miRNAs表达水平的变化,并对差异表达的miRNAs进行靶基因预测、GO和KEGG Pathway富集分析。结果:1.与年轻大鼠相比,老龄大鼠来源的P3MSCs形态呈现明显“衰老样”改变,胞体不规则、边界模糊,细胞表面积增加而长宽比降低;SA-β-gal阳性率明显升高,细胞内ROS含量显著增加,衰老相关因子P16INK4a和Rb1的m RNA表达水平也显著上调。综上,我们建立了自然衰老MSCs模型,后续实验以年轻大鼠来源的P3MSCs为年轻细胞,老龄大鼠来源的P3MSCs为衰老细胞。2.miRNA seq结果显示,与年轻MSCs相比,衰老MSCs中共有163个miRNAs的表达水平发生显著变化,包括77个上调miRNAs和86个下调miRNAs。其中,miR-490-5p、miR-490-3p、miR-433-3p、miR-547-3p、miR-434-5p、miR-341-5p、miR-592-5p、miR-127-3p、miR-96-5p和miR-127-5p的表达在衰老MSCs中显著上调;而miR-298-3p、miR-296-5p、miR-298-5p、miR-204-5p、miR-296-3p、miR-203b-3p、miR-224-3p、miR-452-3p、miR-488-3p和miR-452-5p的表达则明显下调。3.对前10位差异表达的miRNAs进行靶基因预测,分别得到上调miRNAs的靶基因591个,下调miRNAs的靶基因1260个,且下调miRNAs的共有靶基因数量明显多于上调miRNAs的共有靶基因数量。4.对关键miRNAs的靶基因进行GO和KEGG Pathway富集分析发现,上调miRNAs的靶基因主要影响MAPK信号通路、Gn RH通路、FOXO通路以及c AMP通路等,而下调miRNAs的靶基因主要富集于细胞代谢调控、氮化合物代谢调控以及细胞发育进程的调控等生物学过程。结论:1.老龄大鼠MSCs呈衰老改变,SA-β-gal阳性率及细胞内ROS含量增加,P16INK4a和Rb1 m RNA表达水平上调。2.衰老MSCs中共有163个miRNAs的表达水平发生显著变化,其中上调miRNAs 77个,下调miRNAs 86个。3.衰老MSCs中前10位差异表达miRNAs的靶基因主要通过影响细胞代谢调控、MAPK通路以及FOXO通路等生物学过程参与调控MSCs衰老。