乳酸是一种重要的基础化学品,广泛应用于食品、医药、饲料、农药、日用化工、皮革和纺织等行业。乳酸有两个旋光异构体,分别为L-(+)和D-(-)乳酸,由于人体只具有代谢L-乳酸的L-乳酸脱氢酶,因此人体仅能代谢L-(+)乳酸。近年来,以乳酸为单体通过聚合法生产的聚乳酸(polylactic acid,PLA)作为生物降解材料中的一员,具有的无毒、无刺激、高强度,良好的可塑性、易加工成型性且可替代当前广泛使用的塑料材料而成为科学家们的研究热点。目前乳酸主要通过三种方法进行合成:即化学合成法、酶合成法和微生物发酵法,其中,由于微生物发酵法具有反应条件温和、原料来源广泛、生产成本较低、产品光学纯度高、能耗小以及安全可靠性好等优点,已成为目前世界上乳酸制备行业主要的生产方法。国内外大多数以微生物法发酵生产乳酸的工艺研究主要是以玉米、甘薯、马铃薯等粮食作物的淀粉为原料,而对以非粮作物木薯的淀粉为原料发酵生产乳酸的研究则鲜有报道。为了建立木薯淀粉微生物法发酵生产乳酸的工艺,开展了对木薯淀粉生产乳酸发酵工艺条件的优化、通过育种技术获得适合以木薯淀粉为原料生产L-乳酸的乳酸菌、以及鼠李糖乳杆菌组学比较分析这三方面的研究。1.木薯淀粉生产乳酸发酵工艺条件的优化通过单因素实验方法和Plackett-Burman实验方法相结合,对木薯淀粉发酵生产乳酸的发酵条件及培养基的主要因子进行了优化和筛选。实验结果表明:鼠李糖乳杆菌发酵木薯淀粉生产乳酸的种龄为12 h,培养基氮源为酵母粉,MgSO4·7H2O含量为0.4%,MnSO4含量为0.01%,CaCO3含量为707%,接种量为6%;木薯淀粉发酵乳酸的最适温度为37℃,最适pH值为 6.3。通过 Plackett-Burman 实验,从酵母粉、MgSO4·7H2O、MnSO4、CaCO3、接种量、Tween-80、K2HPO4、乙酸钠、柠檬酸二铵等9个因素中筛选出了对乳酸产量具有明显影响的因素为:酵母粉、K2HPO4和MgSO4C7H20,并得到了乳酸产量为响应值的线性回归方程。在单因素和Plackett-Burman实验结果的基础上,对发酵工艺条件优化前后的乳酸产量和糖酸转化率进行比较,结果表明对发酵条件及培养基主要因子的优化能显著地提高木薯淀粉发酵生产乳酸的产量及糖酸转化率,从而为构建以木薯淀粉为原料工业化生产乳酸提供了借鉴和理论依据。2.适合以木薯淀粉为原料生产L-乳酸的乳酸菌选育为了提高鼠李糖乳杆菌的L-乳酸产量及发酵产物中L-乳酸的光学纯度,构建了 D-乳酸脱氢酶基因(ldhD)敲除质粒pUC-ldhD-Ter,并将其转化至鼠李糖乳杆菌JCM1553,筛选获得2株ldhD基因缺陷型的重组鼠李糖乳杆菌。ldhD缺陷型菌株在含10%葡萄糖的摇瓶发酵培养基发酵结果显示:37℃,200rpm发酵 40h,菌体密度 OD600最大达到 12.75士0.21 和 12.33±0.08,残糖含量为(4.31±0.22)g/L 和(4.77±0.74)g/L,乳酸最高产量为(80.07±0.48)g/L和(80.48土 1.94)g/L,葡萄糖转化率则为80.36%和81.04%;在含20%葡萄糖的摇瓶发酵培养基发酵结果显示:37℃,200rpm发酵72h,菌体密度OD60 最大达到 14.52士0.31 和 14.05士0.68,残糖含量为(9.27士0.62)g/L 和(9.39士0.36)g/L,乳酸最高产量为(166.07士2.75)g/L 和(167.90士 1.86)g/L,葡萄糖转化率达到83.83%和84.51%。ldhD缺陷型菌在乳酸产量,糖酸转化率以及发酵残糖上与出发菌株JCM1553无显著区别,这说明ldhD的敲除不能提高鼠李糖乳杆菌L-乳酸的光学纯度和产量。为了进一步探索提高鼠李糖乳杆菌发酵L-乳酸产量的方法,对鼠李糖乳杆菌JCM1553采用传统诱变方法进行诱变选育。通过紫外线和Co60照射的联合诱变,筛选获得1株L-乳酸产量提高的突变株SCT-10-10-60。对SCT-10-10-60抽取不同代数进行L-乳酸发酵性能检测,发现该菌株的L-乳酸发酵性能具有遗传稳定性。在37℃,200 rpm下,该菌株摇瓶发酵葡萄糖60 h的发酵液L-乳酸产量可达195.67 g/L,发酵糖酸转化率达到95.33%,L-乳酸产量、发酵速率和糖酸转化率比出发菌株分别提高了 16.24%、50.13%和17.81%;发酵木薯淀粉84 h的L-乳酸产量最高为227.33 g/L,糖酸转化率达到88.20%,比出发菌株最大L-乳酸产量和发酵速率均提高了 36.95%,且糖酸转化率也提高31.74%。SCT-10-10-60的L-乳酸发酵性能显著优于出发菌株和现有的L-乳酸工业化生产菌株,因此具有较高的潜在工业应用价值。3.鼠李糖乳杆菌组学比较分析研究为了进一步了解微生物产L-乳酸的代谢机制,对出发菌株JCM1553以及通过诱变获得的L-乳酸高产菌株SCT-10-10-60分别进行基因组测序和转录组测序,并在此基础上开展了基因组合转录组层面的比较分析。JCM1553和SCT-10-10-60的基因组测序结果表明两株菌株均为一个长度为2.99 Mb的环状染色,且两株菌株的GC含量也均约为46.8%。通过比较两株菌株的基因组,发现在鼠李糖乳杆菌SCT-10-10-60中有8个该菌株特有的断裂基因,其中包括2个LytR家族转录调控子、2个Rex氧化还原敏感型转录抑制子和4个ABC转运子。对JCM1553和SCT-10-10-60的转录组测序和比较中,发现两株菌株之间有60个表达显著上调的基因(log2fold-change≥2)和39个表达显著下调的基因(log2fold-change≤-2)。对两株菌株的差异表达基因进行KEGG富集分析,结果表明L-乳酸合成前体丙酮酸的代谢途径上两株菌株的基因表达有着显著差异(P<0.05)。基因组层面的断裂基因和转录组层面的丙酮酸代谢途径上表达差异的基因可能就是SCT-10-10-60菌株高产L-乳酸的原因。JCM1553和SCT-10-10-60基因组和转录组的测序信息及比较分析结果为进一步阐明鼠李糖乳杆菌L-乳酸的合成代谢机理,以及为下阶段利用基因工程法提高L-乳酸产量提供了理论依据。综合上述,本论文主要优化和筛选了木薯淀粉发酵生产乳酸过程中发酵的条件及培养基主要因子,并通过尝试不同育种方法最终获得了高产、高效的鼠李糖乳杆菌。在此基础上,对突变菌株和原始菌株进一步开展了基因组学和转录组学方面的比较分析,从而为鼠李糖乳杆菌L-乳酸的合成机制及相关调控机理提供了基因组和转录组层面的信息。这些研究为将来实现高效低成本木薯淀粉L-乳酸发酵工艺的构建以及推动我国L-乳酸工业化发展的进程奠定了基础,同时在理论上加深L-乳酸的合成机制和相关调控机理方面的认知则为乳酸菌的基因工程改造提供了相应的理论指导,因此具有一定的理论和应用意义。