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阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis,T.V)是一种寄生于男女泌尿、生殖道的鞭毛虫,可引起滴虫性阴道炎、前列腺炎和尿道炎等多种生殖系统疾病.目前国内外临床常规检查方法是生理盐水涂片法,但其敏感性受多种因素的影响.培养检测法有利于提高检出率,但检测周期较长,一般需要2～7d<[1]>.关于阴道毛滴虫的致病机制,目前研究较多的是有关虫体黏附宿主上皮细胞过程,这也是阴道毛滴虫能够感染并寄生于宿主细胞的关键性环节.Arroyo<[2]>和Engbringt<[3]>已证明阴道毛滴虫主要通过四种表面黏附蛋白(AP65、AP51、AP33、AP23)黏附于泌尿生殖道上皮细胞.其中ap33基因保守,分子量小.为此我们利用杂交瘤技术,筛选抗重组AP33蛋白单克隆抗体,并对其进行了初步鉴定.
研究目的：
制备阴道毛滴虫黏附蛋白33(AP33)的单克隆抗体(McAb),进行鉴定及初步的应用研究.为进一步研究AP33在阴道毛滴虫黏附过程中的作用,并建立单克隆抗体检测阴道毛滴虫特异性抗原的免疫检测技术提供实验依据.
实验方法:
一、重组AP33的表达、纯化与鉴定在已构建的基因工程(BL21DE3)<[4]>基础上,大量诱导表达获得阴道毛滴虫重组蛋白AP33.用SDS-PAGE分析表达形式.Ni<2+>-NTA亲和层析树脂纯化表达蛋白,SDS.PAGE鉴定其纯度,Bradford法测定蛋白浓度.用间接ELISA法检测重组蛋白免疫原性.以鼠抗T.v全虫抗体为一抗、HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗,用Western blotting检测重组AP33蛋白的抗原性.
二、AP33单克隆抗体的制备和鉴定
1.以纯化所得重组融合蛋白AP33抗原皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,40d后间接ELISA测小鼠尾静脉血以检测免疫效果;
2.将免疫BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞用50﹪聚乙二醇(PEG)融合,HAT培养基培养选择出融合细胞,用建立的间接ELISA法筛选分泌抗AP33抗体的杂交瘤细胞;
3.采用有限稀释法克隆化培养,间接ELISA法检测能稳定分泌抗AP33抗体的阳性杂交瘤细胞株,抗体亚型检测试剂盒测定抗体亚型;
4.单克隆抗体特异性鉴定采用间接ELISA法检测McAb与BL21(DE3)中表达出AP33蛋白,SDS-PAGE电泳显示表达产物主要存在于包涵体中,Mr约为50kDa,Ni<2+>-NTA树脂纯化后纯度约为95﹪:Westem-blotting显示该蛋白可被鼠抗阴道毛滴虫全虫抗原血清所识别;
2.建立检测小鼠AP33抗体的ELISA法,间接ELISA法表明重组蛋白AP33免疫小鼠后的血清可与该重组蛋白及阴道毛滴虫全虫抗原发生反应;
3.融合两次,共接种9块培养板共864孔,538孔有集落生长,融合率约为62.3﹪,克隆化培养得到5株分泌单抗的杂交瘤细胞(4A2,4F11,4F8,4E7和4H11),其抗体类别均为IgG1;
4.间接ELISA法检测结果显示McAb与BL21(DE3)、BL21(DE3)菌体裂解蛋白、阴道杆菌、白色念珠菌及大肠埃希菌无交叉反应.
5.细胞株体外连续培养、反复冻存复苏、液氮中冻存6个月后复苏细胞株,仍可稳定分泌单抗;
6.饱和硫酸铵法和nprotein A sepharose 4FF柱纯化5株细胞株小鼠腹水后,抗体效价为1∶40 000～1∶80 000,蛋白浓度分别为5.0mg/ml,7.5mg/ml,9.6mg/ml,8.3mg/ml,7.8mg/ml.(Bradford法).
7.IFAT 检测该5株单克隆抗体,结果显示其中4株(4F11,4F8,4E7,4H11)可识别阴道毛滴虫T.v317株虫体表面抗原;体外抑制实验结果显示,4F11,4F8,4E7和4H11共4株单抗体外对滴虫黏附有一定的抑制性.
结论：
本实验制备了具有良好免疫原性和抗原性的重组蛋白AP33,初步建立了5株分泌抗重组蛋白AP33抗体的杂交瘤细胞株,分泌的抗体均为IgG1.细胞株稳定性好,分泌抗体效价高,能与重组蛋白AP33及阴道毛滴虫全虫分子量为33kDa抗原分子结合,与大肠埃希菌、阴道杆菌及白色念珠菌无交叉反应.体外实验证实对滴虫黏附有一定的抑制作用.为进一步研究AP33在阴道毛滴虫的黏附过程的作用,并制备检测阴道毛滴虫的试剂盒提供实验依据.