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【研究背景】
骨质疏松症是老龄化人群的一个主要公共卫生问题。随着社会人口老龄化的加剧，骨质疏松症发病率逐年升高，骨质疏松症已成为老龄化人群的常见病。严重影响了病人生活质量，增加了患者痛苦，甚至因并发症导致死亡，同时也给患者和社会造成了沉重的经济负担。
骨质疏松的病理特征为骨量的减少和骨质的改变，伴有骨微结构的异常，导致骨应力的下降和骨折风险的增加。骨质疏松的生物学特征表现为，在细胞学水平，负责骨形成的成骨细胞功能减弱或者执行骨吸收的破骨细胞功能增强都将导致骨质疏松。骨组织发育的过程是一个基因依照严格空间位置和时间顺序表达的过程。骨相关细胞的分化特性、位置、激素和细胞因子等多种因素的调控在骨发育过程中起着重要作用。
CTRP4(C1q/TNF-Related Protein 4)是北京大学医学部王露教授课题组首先发现的，是CTRP家族脂肪因子的一个新成员。CTRP4在人的脂肪组织和脑组织中表达量最高，在其他组织中表达较低。Ctrp4在小鼠脑组织中主要由神经元细胞表达和分泌，在小鼠的下丘脑注射CTRP4-his重组蛋白能够减少小鼠的摄食和体重，说明Ctrp4是中枢性摄食的抑制子。另一方面，CTRP4转基因鼠能够抵制右旋葡聚糖硫酸钠(dextransodium sulfate，DSS)诱导的结肠炎的发生并且抑制结肠炎相关的结肠癌，体现出其抑制炎症和抗癌的强大功能。
源自脂肪细胞的脂肪因子是骨代谢循环调节的重要因子。研究表明，CTRP家族的另一脂肪因子CTRP3在血清中含量的降低与骨质疏松症独立相关，Ctrp3在体外能够抑制Rankl诱导的破骨细胞的分化。然而，尚未有报道研究Ctrp4对由成骨细胞和破骨细胞维持平衡的骨代谢的调控作用及机制。
为探索CTRP4在骨代谢中的作用，采集临床重症骨质疏松患者和对照组、以及人体头低位卧床实验受试志愿者卧床前后的外周血浆，分析了CTRP4的含量变化与骨质疏松的关系；分别在两种骨质疏松模型动物——卵巢去势以及后肢去负荷小鼠检测骨质疏松前后骨组织中Ctrp4mRNA及蛋白的表达变化；通过诱导小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化以及诱导骨髓源性巨噬细胞向破骨细胞分化，检测了Ctrp4对成骨细胞和破骨细胞的作用。本研究在多个层次、多个角度对CTRP4在骨代谢平衡的调控作用进行了研究并初步阐明了可能的机制。
【目的】
研究一种新的脂肪因子CTRP4对于骨代谢平衡的调控作用及其机制。
【方法】
第一部分：1.收集临床重度骨质疏松组(17例)以及对照组(10例)患者的外周EDTA抗凝血浆，采集45日?6o头低位卧床实验志愿者(16例)卧床前后的外周EDTA抗凝血浆，采用ELISA试剂盒检测血浆中CTRP4的表达水平并分析CTRP4与成骨指标的相关性。2.建立两种小鼠骨丢失模型——模拟失重效应的小鼠后肢去负荷模型以及模拟雌激素剥夺效应的小鼠卵巢去势手术模型，检测小鼠后肢股骨和胫骨组织中Ctrp4mRNA和protein的表达丰度变化，观察Ctrp4是否对于骨丢失具有某种响应，其变化趋势是否一致。3.流式细胞术分选尾吊大鼠骨髓中的成骨细胞，检测尾吊后Ctrp4在Alp+细胞中的表达变化。
第二部分：1.原核表达CTRP4-his重组蛋白，并检测其对于前成骨细胞MC3T3-E1增殖的影响；将针对Ctrp4不同位点的几种siRNAs转染细胞，Westernblotting方法鉴定对于Ctrp4具有明显抑制效应的siRNA。2.新鲜分离小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)并诱导其向成骨方向定向分化，在此过程中采用Real-timePCR和Westernblotting方法检测诱导前后Ctrp4mRNA和蛋白的表达变化。3.诱导前成骨细胞MC3T3-E1向成骨细胞定向分化，向细胞转染si-Ctrp4，碱性磷酸酶染色判断Ctrp4对细胞成骨向分化的影响。4.分离小鼠颅骨原代成骨细胞并诱导其向成骨方向分化，给予外源添加原核表达蛋白CTRP4-his或者转染si-Ctrp4，茜素红染色检测Ctrp4对成骨细胞矿化的影响。5.在诱导小鼠BMSCs成骨向方向分化过程中，分别给予外源添加原核表达蛋白CTRP4-his或者转染si-Ctrp4，检测成骨细胞指标Bglap、CollagenⅠ以及成骨相关的转录因子Runx2、OsterixmRNA的表达变化。
第三部分：1.分离小鼠的骨髓源性巨噬细胞BMDMs，诱导其向破骨细胞方向定向分化，检测破骨向诱导分化过程中Ctrp4的表达变化；2.在破骨向诱导分化过程中，给予BMDMs细胞外源添加原核表达蛋白CTRP4-his或者转染si-Ctrp4，TRAP染色检测Ctrp4对于BMDMs细胞破骨向分化的影响；3.检测Ctrp4对BMDMs细胞破骨向诱导分化过程中表达破骨功能指标Trap、Clc7、CtskmRNA的影响。
【结果】
第一部分：1.重度骨质疏松患者血浆中CTRP4水平的均值降低，对照组患者血浆CTRP4的水平与OCN呈正相关，具有统计学意义(R2=0.5075，P=0.0208)；人体卧床45日后血浆CTRP4水平的均值降低，卧床实验受试者卧床0日(正常生理状态下)血浆中CTRP4与ALP呈正相关(R2=0.2839，P=0.0336)。2.成功建立了两种骨质疏松动物模型，并且在这两种骨丢失的小鼠模型骨组织中都检测到Ctrp4mRNA和protein减低的表达。3.在流式细胞术分选的后肢去负荷大鼠模型的骨髓Alp+细胞中检测到Ctrp4mRNA表达的降低，与Bglap和AlpmRNA的表达趋势一致。
第二部分：1.经原核表达和纯化获得2mg去除内毒素的CTRP4-his蛋白；发现CTRP4-his能够剂量依赖性地促进成骨细胞的增殖；筛选出一种对Ctrp4蛋白的表达具有明显抑制效应的siRNA。2.在小鼠BMSCs成骨向诱导分化过程中，Ctrp4mRNA和蛋白表达升高。3.在MC3T3-E1细胞成骨向诱导分化过程中，使用siRNA干涉Ctrp4的表达，诱导7日后碱性磷酸酶染色检测结果显示明显减少的碱性磷酸酶的生成。4.在新生小鼠颅骨原代成骨细胞的成骨向诱导分化过程中，在诱导第21日进行的茜素红染色指示si-Ctrp4转染组比对照组生成的钙化结节减少，外源加入原核表达蛋白CTRP4-his组比其对照组生成的钙化结节明显增多，表明Ctrp4促进了成骨细胞的矿化。5.在小鼠BMSCs成骨向诱导分化过程中，外源添加CTRP4-his促进了成骨标志分子Bglap、CollagenImRNA以及成骨相关转录因子Runx2和OsterixmRNA的表达，转染Ctrp4siRNA则抑制了成骨标志分子Alp和BglapmRNA的表达。
第三部分：1.在小鼠BMDMs源性破骨细胞的定向诱导分化过程中，Ctrp4蛋白表达水平降低。2.TRAP染色显示，转染si-Ctrp4组比对照组融合的破骨细胞数目增加，外源添加CTRP4-his组比对照组融合的破骨细胞数目降低，并且CTRP4-his能够剂量依赖性地抑制破骨细胞的分化。3.在小鼠BMDMs源性破骨细胞的定向诱导分化过程中，外源添加CTRP4-his抑制了破骨细胞功能指标Trap和Ctsk的表达，转染Ctrp4siRNA则促进了破骨细胞功能指标Trap和Clc7的表达。
【结论】
1.骨质疏松的人体和动物标本中CTRP4表达的检测以及CTRP4与成骨指标的相关性分析皆提示，CTRP4与成骨功能指标具有正向相关性。
2.在小鼠BMSCs成骨向诱导分化过程中，Ctrp4的表达与成骨向分化具有正相关；Ctrp4通过促进成骨标志基因Alp、Bglap、CollagenI和核心转录因子Runx2、Osterix的表达加速了成骨细胞的增殖、分化和矿化。
3.在小鼠BMDMs的破骨向诱导分化过程中，Ctrp4的表达与破骨向分化具有负相关；Ctrp4通过抑制破骨相关标志基因Trap、Clc7和Ctsk的表达减缓了BMDMs的破骨向诱导分化。
骨质疏松症是老龄化人群的一个主要公共卫生问题。随着社会人口老龄化的加剧，骨质疏松症发病率逐年升高，骨质疏松症已成为老龄化人群的常见病。严重影响了病人生活质量，增加了患者痛苦，甚至因并发症导致死亡，同时也给患者和社会造成了沉重的经济负担。
骨质疏松的病理特征为骨量的减少和骨质的改变，伴有骨微结构的异常，导致骨应力的下降和骨折风险的增加。骨质疏松的生物学特征表现为，在细胞学水平，负责骨形成的成骨细胞功能减弱或者执行骨吸收的破骨细胞功能增强都将导致骨质疏松。骨组织发育的过程是一个基因依照严格空间位置和时间顺序表达的过程。骨相关细胞的分化特性、位置、激素和细胞因子等多种因素的调控在骨发育过程中起着重要作用。
CTRP4(C1q/TNF-Related Protein 4)是北京大学医学部王露教授课题组首先发现的，是CTRP家族脂肪因子的一个新成员。CTRP4在人的脂肪组织和脑组织中表达量最高，在其他组织中表达较低。Ctrp4在小鼠脑组织中主要由神经元细胞表达和分泌，在小鼠的下丘脑注射CTRP4-his重组蛋白能够减少小鼠的摄食和体重，说明Ctrp4是中枢性摄食的抑制子。另一方面，CTRP4转基因鼠能够抵制右旋葡聚糖硫酸钠(dextransodium sulfate，DSS)诱导的结肠炎的发生并且抑制结肠炎相关的结肠癌，体现出其抑制炎症和抗癌的强大功能。
源自脂肪细胞的脂肪因子是骨代谢循环调节的重要因子。研究表明，CTRP家族的另一脂肪因子CTRP3在血清中含量的降低与骨质疏松症独立相关，Ctrp3在体外能够抑制Rankl诱导的破骨细胞的分化。然而，尚未有报道研究Ctrp4对由成骨细胞和破骨细胞维持平衡的骨代谢的调控作用及机制。
为探索CTRP4在骨代谢中的作用，采集临床重症骨质疏松患者和对照组、以及人体头低位卧床实验受试志愿者卧床前后的外周血浆，分析了CTRP4的含量变化与骨质疏松的关系；分别在两种骨质疏松模型动物——卵巢去势以及后肢去负荷小鼠检测骨质疏松前后骨组织中Ctrp4mRNA及蛋白的表达变化；通过诱导小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化以及诱导骨髓源性巨噬细胞向破骨细胞分化，检测了Ctrp4对成骨细胞和破骨细胞的作用。本研究在多个层次、多个角度对CTRP4在骨代谢平衡的调控作用进行了研究并初步阐明了可能的机制。
【目的】
研究一种新的脂肪因子CTRP4对于骨代谢平衡的调控作用及其机制。
【方法】
第一部分：1.收集临床重度骨质疏松组(17例)以及对照组(10例)患者的外周EDTA抗凝血浆，采集45日?6o头低位卧床实验志愿者(16例)卧床前后的外周EDTA抗凝血浆，采用ELISA试剂盒检测血浆中CTRP4的表达水平并分析CTRP4与成骨指标的相关性。2.建立两种小鼠骨丢失模型——模拟失重效应的小鼠后肢去负荷模型以及模拟雌激素剥夺效应的小鼠卵巢去势手术模型，检测小鼠后肢股骨和胫骨组织中Ctrp4mRNA和protein的表达丰度变化，观察Ctrp4是否对于骨丢失具有某种响应，其变化趋势是否一致。3.流式细胞术分选尾吊大鼠骨髓中的成骨细胞，检测尾吊后Ctrp4在Alp+细胞中的表达变化。
第二部分：1.原核表达CTRP4-his重组蛋白，并检测其对于前成骨细胞MC3T3-E1增殖的影响；将针对Ctrp4不同位点的几种siRNAs转染细胞，Westernblotting方法鉴定对于Ctrp4具有明显抑制效应的siRNA。2.新鲜分离小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)并诱导其向成骨方向定向分化，在此过程中采用Real-timePCR和Westernblotting方法检测诱导前后Ctrp4mRNA和蛋白的表达变化。3.诱导前成骨细胞MC3T3-E1向成骨细胞定向分化，向细胞转染si-Ctrp4，碱性磷酸酶染色判断Ctrp4对细胞成骨向分化的影响。4.分离小鼠颅骨原代成骨细胞并诱导其向成骨方向分化，给予外源添加原核表达蛋白CTRP4-his或者转染si-Ctrp4，茜素红染色检测Ctrp4对成骨细胞矿化的影响。5.在诱导小鼠BMSCs成骨向方向分化过程中，分别给予外源添加原核表达蛋白CTRP4-his或者转染si-Ctrp4，检测成骨细胞指标Bglap、CollagenⅠ以及成骨相关的转录因子Runx2、OsterixmRNA的表达变化。
第三部分：1.分离小鼠的骨髓源性巨噬细胞BMDMs，诱导其向破骨细胞方向定向分化，检测破骨向诱导分化过程中Ctrp4的表达变化；2.在破骨向诱导分化过程中，给予BMDMs细胞外源添加原核表达蛋白CTRP4-his或者转染si-Ctrp4，TRAP染色检测Ctrp4对于BMDMs细胞破骨向分化的影响；3.检测Ctrp4对BMDMs细胞破骨向诱导分化过程中表达破骨功能指标Trap、Clc7、CtskmRNA的影响。
【结果】
第一部分：1.重度骨质疏松患者血浆中CTRP4水平的均值降低，对照组患者血浆CTRP4的水平与OCN呈正相关，具有统计学意义(R2=0.5075，P=0.0208)；人体卧床45日后血浆CTRP4水平的均值降低，卧床实验受试者卧床0日(正常生理状态下)血浆中CTRP4与ALP呈正相关(R2=0.2839，P=0.0336)。2.成功建立了两种骨质疏松动物模型，并且在这两种骨丢失的小鼠模型骨组织中都检测到Ctrp4mRNA和protein减低的表达。3.在流式细胞术分选的后肢去负荷大鼠模型的骨髓Alp+细胞中检测到Ctrp4mRNA表达的降低，与Bglap和AlpmRNA的表达趋势一致。
第二部分：1.经原核表达和纯化获得2mg去除内毒素的CTRP4-his蛋白；发现CTRP4-his能够剂量依赖性地促进成骨细胞的增殖；筛选出一种对Ctrp4蛋白的表达具有明显抑制效应的siRNA。2.在小鼠BMSCs成骨向诱导分化过程中，Ctrp4mRNA和蛋白表达升高。3.在MC3T3-E1细胞成骨向诱导分化过程中，使用siRNA干涉Ctrp4的表达，诱导7日后碱性磷酸酶染色检测结果显示明显减少的碱性磷酸酶的生成。4.在新生小鼠颅骨原代成骨细胞的成骨向诱导分化过程中，在诱导第21日进行的茜素红染色指示si-Ctrp4转染组比对照组生成的钙化结节减少，外源加入原核表达蛋白CTRP4-his组比其对照组生成的钙化结节明显增多，表明Ctrp4促进了成骨细胞的矿化。5.在小鼠BMSCs成骨向诱导分化过程中，外源添加CTRP4-his促进了成骨标志分子Bglap、CollagenImRNA以及成骨相关转录因子Runx2和OsterixmRNA的表达，转染Ctrp4siRNA则抑制了成骨标志分子Alp和BglapmRNA的表达。
第三部分：1.在小鼠BMDMs源性破骨细胞的定向诱导分化过程中，Ctrp4蛋白表达水平降低。2.TRAP染色显示，转染si-Ctrp4组比对照组融合的破骨细胞数目增加，外源添加CTRP4-his组比对照组融合的破骨细胞数目降低，并且CTRP4-his能够剂量依赖性地抑制破骨细胞的分化。3.在小鼠BMDMs源性破骨细胞的定向诱导分化过程中，外源添加CTRP4-his抑制了破骨细胞功能指标Trap和Ctsk的表达，转染Ctrp4siRNA则促进了破骨细胞功能指标Trap和Clc7的表达。
【结论】
1.骨质疏松的人体和动物标本中CTRP4表达的检测以及CTRP4与成骨指标的相关性分析皆提示，CTRP4与成骨功能指标具有正向相关性。
2.在小鼠BMSCs成骨向诱导分化过程中，Ctrp4的表达与成骨向分化具有正相关；Ctrp4通过促进成骨标志基因Alp、Bglap、CollagenI和核心转录因子Runx2、Osterix的表达加速了成骨细胞的增殖、分化和矿化。
3.在小鼠BMDMs的破骨向诱导分化过程中，Ctrp4的表达与破骨向分化具有负相关；Ctrp4通过抑制破骨相关标志基因Trap、Clc7和Ctsk的表达减缓了BMDMs的破骨向诱导分化。