猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的病毒性传染病。该病以妊娠母猪的繁殖障碍和各年龄猪高死亡率以及呼吸道症状为特征。PRRSV感染仅能诱导低水平的中和抗体，并且在体内持续性存在，诱发继发感染，给PRRSV的防治带来很大的困难。　　 病毒感染可以激活宿主的免疫系统，包括非特异性的天然免疫防御系统和特异性的免疫应答防御系统。天然免疫是宿主对抗病毒入侵的第一道防线，在病毒感染的初期发挥着重要作用。干扰素，作为一种重要的抗病毒因子是宿主防御病毒感染的主体。泛素在天然免疫信号传导中发挥重要作用，许多病毒通过调节宿主的泛素化，阻断天然免疫反应，进而影响干扰素的产生，从而逃避宿主的抗病毒感染反应，而PRRSV具有逃避宿主天然免疫的能力，它是否也通过泛素来调节干扰素的产生，进而逃避宿主的免疫反应呢？　　 本研究发现PRRSV感染可以明显的减少细胞蛋白泛素化，而Nsp11是PRRSV调节细胞泛素化水平的关键非结构蛋白，并参与调节宿主I-IFN信号传导的泛素化。具体研究内容及结果如下：　　 1.PRRSV感染对细胞蛋白泛素化的影响　　 为了研究PRRSV感染对细胞蛋白多聚泛素化的影响，检测了PRRSV感染Marc-145细胞后，不同时间点细胞蛋白泛素化的变化。和对照组相比，病毒感染的整个时间段内细胞蛋白泛素化水平逐渐降低，并以病毒感染24 h时细胞蛋白泛素化水平降低最为显著，但是在病毒感染的后期(36-48h)泛素化程度有所增加。而紫外灭活的病毒不能引起细胞蛋白泛素化的变化，说明细胞蛋白泛素化的下降依赖于病毒的增殖。　　 2.PRRSV Nsp11具有去泛素化蛋白酶活性　　 由于PRRSV感染对细胞蛋白泛素化的影响依赖于病毒的增殖，说明PRRSV的非结构蛋白可能在其中起着重要的作用。于是构建了PRRSV WUH3株所有非结构蛋白基因的真核表达质粒，将这些真核表达质粒分别和Flag-Ub质粒共转染HEK293细胞，于转染后30h收样检测细胞泛素化水平，结果发现超表达Nsp2和Nsp11导致细胞蛋白泛素化水平明显降低，并且与Nsp2相比，Nsp11表现出更强的去泛素化蛋白酶活性(DUB)，且呈剂量依赖性。　　 3.PRRSV Nsp11去除K48泛素，但对K63泛素无作用　　 泛素化修饰的主要形式包括K48和K63链接的多聚泛素链修饰。为了进一步确定Nsp11能够识别哪种链接形式的泛素化修饰，将HA-K48-Ub或HA-K63-Ub瞬时转染HEK293细胞，结果显示，超表达Nsp11可以去除K48链接的泛素，且呈剂量依赖性，但不影响K63链接的泛素。　　 4.D144、K173、D180和Y219位点对Nsp11的DUB活性很重要　　 PRRSV Nsp11编码内切核糖核酸酶(NendoU)，该序列在尼多目病毒家族成员中极为保守。为了研究NendoU活性位点是否参与Nsp11的去泛素化蛋白酶活性，利用点突变技术构建了一系列NendoU活性缺失突变体(H129A、H144A、K173A、D180A、D204A、Y219A)。结果显示，和野生型Nsp11相比，H144A、K173A、D180A和Y219A突变体去泛素化能力均有一定程度的减弱。　　 5.Nsp11的DUB活性对其抑制NF-κB的激活至关重要　　 泛素参与I-IFN信号传导通路中信号分子的泛素化，利用双荧光素酶实验，发现Nsp11下调SEV/poly(I：C)诱导的IFN-β、NF-κB及IRF3激活，并呈剂量依赖性。为了进一步证实Nsp11的DUB活性与其抑制I-IFN的产生有关，分析了具有不同去泛素化活性的Nsp11突变体对SeV/poly(I：C)诱导IFN-β、NF-κB和IRF3产生的影响。结果发现几乎所有的突变体都失去了抑制SeV/poly(I：C)诱导的IFN-β和IRF3激活，但只有失去DUB活性的突变体才抑制ploy(I：C)诱导的NF-κB激活。这进一步证实Nsp11抑制SeV/poly(I：C)诱导的NF-κB激活的能力依赖于其去泛素化活性。　　 6.Nsp11通过去除K48链接的泛素抑制IκBα降解来抑制NF-κB激活　　 IκBα的K48泛素化是导致NF-κB激活的关键步骤。为了证实PRRSV Nsp11是否通过去除IκBα的K48泛素化而抑制IκBα的降解，从而抑制NF-κB的激活，利用TNF-α刺激HEK293细胞，结果发现：和空载体对照组相比，TNF-α诱导的IκBα降解在一定程度上被Nsp11阻断，表明Nsp11通过阻止IκBα降解来抑制NF-κB的激活。免疫共沉淀实验发现IκBα和K48-Ub存在相互作用，并且Nsp11可以明显的去除IκBα上的K48链接泛素形式。突变体试验再次证实失去DUB活性的Nsp11突变体(H129A、K173A、D180A和Y219A)不能去除IκBα上的K48链接的泛素形式，说明Nsp11通过去除IκBα上K48链接的泛素化修饰来抑制IκBα降解，进而抑制NF-κB激活。