隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)感染动物和人引起的一种寄生虫病,以自限性水样腹泻为主要症状。隐孢子虫能感染170多种动物,其中哺乳动物至少有79种。隐孢子虫卵囊在环境中普遍存在,人类可以通过多种途径获得感染。但目前隐孢子虫病还没有特效的治疗药物,因而对其进行检测与预防很重要。本实验利用酶切法从重组质粒pMD18-T-P23中获得隐孢子虫鼠基因型(Cryptosporidium mouse genotype)P23基因,克隆到pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达质粒pGEX-P23。将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果发现rP23可分别与兔隐孢子虫感染兔阳性血清、贝氏隐孢子虫感染鸡阳性血清、微小隐孢子虫感染牛阳性血清、隐孢子虫鼠基因型感染鼠阳性血清特异性反应,而不与兔、鸡、牛、鼠阴性血清反应,表明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。以纯化的重组蛋白rP23为抗原,建立隐孢子虫间接ELISA检测方法,对其敏感性、特异性和重复性进行观察;利用建立的方法,对临床血清样品进行检测。结果成功地建立了隐孢子虫间接ELISA检测技术,其最适抗原包被浓度为2μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:800,酶标二抗最佳稀释倍数为1:2000,具有良好的特异性、敏感性和重复性。利用建立的rP23-ELISA检测方法,对23份临床血清样品进行了检测,并与Sheather’s蔗糖漂浮法、nested PCR法检测结果进行比较。结果显示,建立的rP23-ELISA方法检出率高于Sheather’s蔗糖漂浮法和nested PCR法。表明该方法具有敏感性高、特异性强,重复性好、价格低廉、操作简单、能批量检测等特点,可用来对临床样品进行检测,为研制隐孢子虫病ELISA检测试剂盒打下了基础。为建立微小隐孢子虫体外感染模型,并对其在细胞内的生长发育过程进行观察,利用人回盲肠癌细胞(HCT-8细胞)作为感染细胞,采用不同的接种细胞浓度和培养血清浓度进行培养。结果,在6孔培养板中接种1×106、5×105、1×105个细胞后,在24 h、48 h、72 h后长成70~80%单细胞层,可以用来接种1×105个微小隐孢子虫。用含有1%血清浓度的培养基来培养微小隐孢子虫,培养72 h后,通过Crypt-a-Glo?和Sporo-Glo?抗体荧光染色,成功观察到了隐孢子虫各个阶段虫体的形态。为探索绿色荧光蛋白(EGFP)在隐孢子虫中的瞬时表达情况,分别扩增了微小隐孢子虫自身蛋白子孢子表面抗原CP15、热激蛋白70、组蛋白H4、肌动蛋白、微管素蛋白和ATP酶的启动子序列,并将外源蛋白EGFP基因置于其启动子中,共构建了30个穿梭转染质粒。通过电转染导入微小隐孢子卵囊中,培养72 h后,用流式细胞仪、荧光显微镜和RT-PCR检测EGFP表达情况。结果pSEI和pAET两个质粒转染组流式细胞仪和荧光显微镜检测均观察到EGFP荧光,RT-PCR检测扩增出了特异性条带,表明本研究建立了隐孢子虫体内瞬时转染系统,可以在隐孢子虫体内表达绿色荧光,为下一步稳定表达外源蛋白打下了基础。