研究目的:放创复合伤（Combined radiation and wound injury,CRWI）主要见于肿瘤放疗以及核辐射损伤等合并创伤的患者。在所有癌症患者中,近三分之二在治疗过程中接受放射疗法,经常导致急性皮肤和黏膜的损害。近年来恐怖主义活动依然猖獗,其中最令人担忧的是发生核事故,因此有必要研究针对放创复合伤的医疗对策以防止由于生物恐怖主义行为和癌症治疗而引起的辐射伤害。经电离辐射的创口迁延难愈,皮瓣出现坏死,成为目前亟待解决的临床难题。以往研究表明对于放射暴露的早期和晚期并发症,干细胞疗法可以改善辐射损伤对皮肤组织的不良影响,促进组织愈合。HPMSCs凭借其与生俱来的优势,如获取手段的非侵入性、易于获取、更少的伦理限制、多潜能性、低免疫原性和免疫调节作用成为干细胞的主要来源。瘦素（Leptin）是一种多效的细胞因子,目前Leptin在伤口愈合中已证实也发挥着重要的作用。费等的研究发现表达外源性Leptin基因的HPMSCs能显著提高CRWI皮瓣的成活率,提示干细胞疗法结合基因疗法在CRWI伤口愈合中具有的潜在的研究及应用价值,但转染Leptin的HPMSCs对放射后皮肤或黏膜修复细胞的作用尚不明确。本研究基于之前的研究结果,通过建立口腔牙龈黏膜修复细胞放创复合伤体外模型,进一步研究HPMSCs/Leptin对牙龈黏膜修复细胞的趋化能力、增殖能力以及炎症因子分泌水平的影响,为后续实验研究提供依据。研究方法:1、实验分组实验随机分为HPMSCs/NC组（对照组,L.v.-pEB-copGFP（T2A）PURO）和HPMSCs/leptin组（实验组,L.v.-pEB-copGFP（T2A）PURO-leptin）,HPMSCs/NC和HPMSCs/leptin均培养于含10%血清、1%双抗的DMEM-LG培养基中,置于CO₂孵箱中培养（培养条件为5%CO₂、饱和湿度、37℃）。2、辐照处理与Transwell检测复苏HOK、HGnF和HUVEC细胞加入到含10%血清、1%双抗的DMEM-LG培养基中,置于CO₂孵箱中培养。当细胞融合度均达到90%时,进行单次X射线辐射,剂量20GY。选择8.0um PET膜的Transwell系统,使用无血清的DMEM重悬辐照后的HOK、HGnF和HUVEC,各取100ul（约含细胞1×105个）加入Transwell的小室上室,在下室加入1×104个HPMSCs/NC或HPMSCs/leptin细胞,孵育48h后弃去上室细胞,4%多聚甲醛固定膜下表面的细胞,结晶紫染色,倒置荧光显微镜下观察拍照,随机选择图片并计数。3、构建共培养体系选择0.4um PET膜的Transwell系统,取辐照后的HOK、HGnF和HUVEC细胞悬液400ul（含细胞1×105个）分别加入上室,下室加入HPMSCs/Leptin或HPMSCs/NC各200ul（含细胞1×104个）,置于CO₂孵箱中培养。构建六组共培养体系即实验组:HGnF+HPMSCs/Leptin、HOK+HPMSCs/Leptin、HUVEC+HPMSCs/Leptin;对照组:HGnF+HPMSCs/NC、HOK+HPMSCs/NC、HUVEC+HPMSCs/NC。4、通过CCK-8检测被X射线辐照后三种细胞在24h、48h、72h、96h的增殖活性,ELISA检测被X射线辐照后三种细胞在24h、48h、72h表达炎症因子（人IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、GM-CSF和TNF-α）的水平研究结果:1、Transwell检测结果HPMSCs/NC和HPMSCs/Leptin对辐照后的HGnF、HOK和HUVEC均有不同程度的趋化性（如图2.3.1）,相比于HPMSCs/NC组,将HPMSCs/Leptin组置于Transwell模型下室时,能使更多的HUVEC迁移到下室,表明HPMSCs/Leptin能促进HUVEC的迁移,推测HPMSCs/Leptin对HUVEC的趋向性增强;但相比于HPMSCs/Leptin组,将HPMSCs/NC组置于Transwell模型下室时,能使更多的HGnF和HOK迁移到下室,表明HPMSCs/Leptin抑制HGnF和HOK的迁移,推测HPMSCs/Leptin对HGnF和HOK的趋向性减弱。2、细胞增殖活性的CCK-8检测结果如图2.3.3A所示,HGnF+HPMSCs/Leptin混合培养体系的OD₄₅₀值与HGnF+HPMSCs/NC混合培养体系的OD₄₅₀值无显著性差异（P>0.05）,表明HPMSCs/Leptin对辐照损伤后的HGnF的增殖能力影响不大。图2.3.2B显示,HOK+HPMSCs/Leptin混合培养体系的OD₄₅₀值显著高于HOK+HPMSCs/NC混合培养体系的OD₄₅₀值（0.001450值显著低于HOK+HPMSCs/NC混合培养体系的OD₄₅₀值,其原因可能是HOK+HPMSCs/NC混合培养体系0h的OD₄₅₀值稍高于HOK+HPMSCs/Leptin混合培养体系。图2.3.2C显示,HUVEC+HPMSCs/Leptin混合培养体系的OD₄₅₀值显著高于HUVEC+HPMSCs/NC混合培养体系的OD₄₅₀值（P<0.001）,表明HPMSCs/Leptin能促进辐照损伤后的HUVEC的增殖。3、ELISA检测结果采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定辐照损伤后24h、48h和72h各混合培养体系中分泌的炎性细胞因子浓度。与对照混合培养体系（HGnF+HPMSCs/NC、HOK+HPMSCs/NC）相比,实验混合培养体系（HGnF+HPMSCs/Leptin、HOK+HPMSCs/Leptin、）培养基上清液中人IL-1α、GM-CSF和TNF-α在各时间段（辐照后24h、48h和72h）的分泌量显著高于对照混合培养体系（P<0.05）。在辐照损伤后72h,检测各混合培养体系培养基上清液中人IL-6的分泌量,HOK+HPMSCs/NC和HOK+HPMSCs/Leptin间无显著性差异（P>0.05）,混合培养体系HGnF+HPMSCs/Leptin显著高于其对照混合培养体系HGnF+HPMSCs/NC（P<0.001）。此外,各混合培养体系中人IL-1β和IL-8的分泌量太少而未能检测出。综上,实验结果表明,HPMSCs/Leptin能促进HGnF、HOK分泌炎症因子人IL-1α、IL-6、GM-CSF和TNF-α。研究结论:1、HPMSCs/Leptin可促进HUVEC的迁移,抑制HGnF和HOK的迁移。2、HPMSCs/Leptin能增强辐照损伤后的HOK和HUVEC的增殖能力,但对HGnF的增殖影响不明显。3、HPMSCs/Leptin能促进HGnF、HOK和HUVEC分泌炎症因子人IL-1α、IL-6、GM-CSF和TNF-α,但对人IL-1β和IL-8的分泌无明显影响。