论文部分内容阅读
目的:醛酮还原酶1B10(aldo-keto reductase 1B10,AKR1B10)在肝癌组织中表达升高,有研究表明其与肝癌早期诊断和预后密切相关,本文将探讨AKR1B10在HepG2肝癌细胞中对细胞增殖和细胞周期的影响及作用机制。研究方法:1)L02、Hep G2、Huh-7人肝(癌)细胞培养;2)采用慢病毒LV-AKR1B10-shRNA感染HepG2肝癌细胞,荧光显微镜、蛋白质印迹法(Western blot)及实时荧光定量PCR法(RT-qPCR)检测AKR1B10的转染效率,空载体组命名为HepG2/NC,目的组命名为HepG2/AKR1B10;3)通过测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸在340 nm处吸光度值的下降检测AKR1B10的活性;4)CCK-8法检测0、50、75、100、125、150μmol/L依帕司他分别培养HepG2细胞24、48、72h后HepG2细胞的增殖活性;CCK-8法检测HepG2、Hep G2/NC、Hep G2/AKR1B10肝癌细胞24、48、72h的增殖活性;5)流式细胞术检测0、50、100μmol/L依帕司他培养HepG2细胞24h后细胞各期的比例;流式细胞术检测HepG2、HepG2/NC、HepG2/AKR1B10细胞周期的比例;6)Western blot检测0、25、50、100μmol/L依帕司他培养HepG2细胞24h后p-Rb、cyclinD1、cyclinE1、p27的蛋白表达水平,Western blot检测HepG2、HepG2/NC、HepG2/AKR1B10细胞中p-Rb、cyclinD1、cyclin E1、p27的蛋白表达水平。7)所有数据以均数±标准差(?x±s)进行统计描述,两组间比较采用独立样本t检验,所有实验均重复三次,采用SPSS 24.0软件进行数据的统计学分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1)AKR1B10在肝癌细胞中表达升高。和正常肝细胞L02相比,HepG2肝癌细胞中AKR1B10蛋白相对表达水平为6.71±1.11(P=0.012)。Huh-7细胞中AKR1B10蛋白相对表达水平为3.32±0.39(P=0.009)。2)构建AKR1B10低表达HepG2细胞系,相比于空载组,稳定转染株AKR1B10 RNA表达水平为0.19±0.03(P=0.001)。AKR1B10蛋白水平为0.24±0.07(P=0.002),转染效率约为70%～80%。3)50,75,100,125,150μmol/L依帕司他分别作用于HepG2细胞24,48,72h后,随着依帕司他的作用浓度和作用时间的增加,对HepG2细胞的抑制率逐渐增加;HepG2/NC细胞培养24,48,72h的吸光度值分别为0.67±0.06,1.34±0.05,1.82±1.11;而HepG2/AKR1B10细胞培养24,48,72h的吸光度值为0.54±0.06,1.02±0.09,1.36±0.08,较空载体组显著降低(P<0.05);4)依帕司他可以显著抑制AKR1B10酶活性,呈剂量依赖性特点,然而与对照组相比,不同浓度依帕司他处理的HepG2细胞中AKR1B10的表达水平并无明显变化;5)相比对照组,100μM依帕司他可显著增加HepG2细胞G1期的比例(65.44±1.78比61.29±1.81,P=0.047)。与HepG2/NC细胞相比,HepG2/AKR1B10细胞中G1期的比例显著增高(58.24±1.14比49.33±2.94,P=0.008)。6)Western blot结果表明,50、100μmol/L依帕司他可显著抑制细胞周期蛋白cyclinD1,cyclinE1和p-Rb的表达,同时促进周期素依赖性激酶抑制蛋白p27的表达,呈浓度依赖性。与HepG2/NC细胞相比,HepG2/AKR1B10细胞cyclinD1,cyclin E1和p-Rb的表达下降,而p27的表达上调。结论:抑制AKR1B10促进肝癌细胞G0/G1期阻滞,抑制肝癌细胞增殖;AKR1B10通过p27/p-Rb信号通路参与肝癌细胞周期调控