论文部分内容阅读
玉米(Zea mays L.)为禾本科,玉蜀黍属一年生草本C4植物,起源于热带或亚热带地区。玉米用途十分广泛,是重要的饲料作物,又是食品、化工、燃料及医药等行业的重要原料,因此全球玉米种植面积居粮食作物首位,我国的玉米种植面积也于2008年超过水稻成为第一大粮食作物。玉米在我国国家粮食安全中起着极其重要的作用,生产生活中对玉米的需求不断增加,因而向高纬度、高海拔地区拓展种植区域的需求不断增加。但是起源于热带、亚热带地区的玉米,在生长周期中表现出对低温冷害较为敏感,在整个生长周期过程中极易遭受低温冷害的影响而导致减产。因此,研究玉米冷响应分子机理、培育抗冷玉米新种质新品种,提高玉米的冷适应能力具有重要的现实意义。本研究从形态学、细胞学、分子生物学等各个方面分析了两个不同耐冷性玉米自交系W9816和B73的特征。通过形态学比较,W9816在冷处理后受伤害程度较轻而B73萎蔫严重。细胞学证据表明W9816气孔较短而B73气孔较长;冷处理后B73积累更多的质体小球,细胞膜结构伤害严重,而W9816冷处理后质体小球较少。生理生化特征分析表明,冷处理后B73中相对电导率、MDA含量更高,而W9816中SOD、CAT和脯氨酸含量更高。NO含量分析表明冷处理后W9816相对升高更多。ABA含量分析表明,冷处理后W9816中ABA含量显著高于B73。脂肪酸成分分析结果表明,冷处理后W9816中亚麻酸(18:3)含量下降相对较少,而异油酸(18:1)、亚油酸(18:2)较B73增加更多。对laccase、myb31、nnr1和px3等基因的分析表明它们在W9816中表达量更高。综合细胞学、分子生物学等证据表明不同玉米自交系有不一样的冷响应途径。MiRNA是长度为21-24 nt的一类非翻译RNA片段,近年来在很多物种里面都发现了大量的miRNA,它们的表达对植物响应生物与非生物胁迫具有重要的作用。本研究运用二代测序技术,对苗期玉米自交系W9816和B73的miRNA表达谱进行分析。miRNAome分析发现冷处理后上调表达的miRNA有11个:包括miR166c/b/d、miR171、miR156、miR398、zma-miR399e和miR408等。冷处理后下调表达的miRNA有26个:包括miR159、miR167、miR319、miR393、zma-miR399a/b/c/h和miR166h等。W9816和B73之间差异表达的miRNA有80个,其中W19816中表达量较高的miRNA有:zma-miR164、zma-miR156h、zma-miR393、zma-miR398;B73中表达量较高的miRNA有:zma-miR156e/k、zma-miR159,zma-miR160、zma-miR2118b、zma-miR399等。注释到冷处理前后差异表达miRNA靶基因有28个,主要为MYB类转录因子、激酶等,GO分析表明这些靶基因参与了生长素介导的信号通路、RNA代谢调节、DNA转录过程,低温还影响到花器官、分生组织和叶片的发育等过程。KEGG代谢通路分析表明冷处理差异表达miRNA的靶基因参与了戊糖磷酸途径代谢、糖酵解等糖代谢,谷氨酸等氨基酸的代谢等生物学过程。两个玉米自交系间差异表达miRNA的靶基因有65个,主要为ARF、SBP、MYB类转录因子等,GO分析表明这些靶基因参与了植物生长发育,胁迫响应,激素应答等诸多生物学过程。KEGG代谢通路分析表明,材料间差异表达miRNA的靶基因涉及到内质网中蛋白质的加工,植物激素信号转导过程,细胞的自噬调节以及剪接体通路等代谢途径。miRNA表达谱的研究及靶基因分析描绘了玉米冷响应miRNA及其靶基因的整体轮廓。由于B73基因组已经测序完成,研究选取B73进行降解组分析。结果共检测到miRNA靶基因158个发生降解,检测到160个靶基因降解位点。通过降解组测序检测到miR156、miR159、miR166和miR171等4个冷处理前后差异表达miRNA的靶基因剪切产物,它们可能在冷响应过程起重要作用。通过RLM-RACE技术检测到5个miR171的靶基因,均属于GRAS基因家族,剪切位点大多位于互补区域miRNA 5’末端起第10-11位及11-12位之间。降解组测序结合生物信息学分析提示我们一些miRNA可能在冷响应过程中起关键作用。通过Northern blot和qRT-PCR分析表明zma-miR156k-5p、zma-miR164a-5p、zma-miR171d-5p和zma-miR398a-3p在冷处理后上调表达;zma-miR167a-5p、zma-miR319a-3p及miR-n2在冷处理后下调表达。zma-miR2118b、zma-miR393b-5p zma-miR-n8和zma-miR-n9等在W9816和B73中冷处理后呈现不同的表达模式。进一步将miRNA的前体片段转入拟南芥中过表达,分析玉米miRNA在拟南芥背景下的影响。拟南芥中异位表达玉米miR164、miR171和miR398基因使转基因拟南芥根长变长,提高了低温条件下的发芽率,从而提高植物的抗冷性。总之,本研究通过对两个玉米自交系进行比较分析,在miRNA组和降解组水平勾画出差异表达的miRNA及其靶基因的整体轮廓,为全面阐释苗期玉米miRNAs调控的抗冷分子机理奠定了良好的基础。