关节软骨缺损是临床的难题之一,自体关节软骨移植存在来源有限、创伤大、费用高等缺点,异体关节软骨移植难以排除免疫源性的问题。随着组织工程的发展,利用人工再生组织来修复关节软骨缺损,为临床解决这一难题提供了新的思路和方法。虽然关节软骨组织工程的研究已经取得了很大进展,但仍有大量的问题等待解决。尤其是软骨和软骨下骨的分层、断裂问题,和宿主的整合问题,关节软骨修复的长期效果等。研究目的将胶原、壳聚糖与β-磷酸三钙(Tricalcium Phosphate,TCP)有机复合,模仿体内关节软骨的分层结构,增加支架材料的力学强度,构建胶原/壳聚糖/β-TCP层状梯度支架材料。分别将扩增的经成骨诱导的兔骨髓间充质干细胞(BoneMesenchymal Stem Cells,BMSCs)和软骨细胞植入其中体外微重力下培养,对照组采用普通培养板培养,观察成骨细胞和软骨细胞在胶原/壳聚糖/β-TCP层状梯度修复体中的黏附、增殖及生物学性状变化,以评价该复合材料作为关节软骨组织工程支架的可行性,并观察模拟微重力对细胞及构建组织的效用。研究方法以细胞和支架材料为实验对象,以普通培养和微重力培养分两组对照。MTT实验分组:5个时间组:1天、3天、5天、7天、9天。5个平行孔/组,两培养组共50孔。1.成骨细胞和材料复合:用全骨髓贴壁筛选法培养新西兰兔原代BMSCs,体外扩增后进行成骨诱导,3周后检测细胞碱性磷酸酶活性和钙结节生成情况,诱导成功后和修复体复合体外普通培养和旋转培养仪模拟微重力培养,进行MTT检测比较两组细胞增殖情况并观察模拟微重力对细胞的影响;培养1周后行扫描电镜检查观察成骨细胞在修复体材料内黏附生长情况;4周后,细胞和材料复合物脱钙、石蜡包埋、切片,行苏木精一伊红染色及Ⅰ型胶原免疫组织化学染色,观察成骨细胞的生物学性状变化及模拟微重力对复合物的力学影响。2.软骨细胞和材料复合:取新西兰幼兔的关节软骨消化培养软骨细胞体外培养扩增,取2、3代细胞行s—100细胞免疫化学染色,收集前4代软骨细胞作为种子细胞和修复体复合体外普通培养和旋转培养仪模拟微重力培养,进行MTT检测比较两组细胞增殖情况并观察模拟微重力对软骨细胞的影响;培养7天后行扫描电镜检查观察软骨细胞在修复体材料内黏附生长情况;4周后,细胞和材料复合物进行脱钙、石蜡包埋、切片,行苏木精—伊红染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察软骨细胞的生物学性状变化及模拟微重力对复合物的力学影响。统计学分析:MTT实验中,相同时间点两组之间的比较用两独立样本t检验;同组不同时间点比较采用完全随机设计单因素方差分析(One-way ANOVA);两组整体之间比较采用重复测量数据的方差分析。α=0.05为统计学检验水准。研究结果1.细胞形态:初接种时BMSCs呈球形,悬浮在培养液中,24h后开始贴壁,细胞呈长梭形,少量多角形,约1周左右细胞铺满培养瓶。加入成骨诱导培养液后细胞生长相对缓慢,其形态发生了改变,细胞逐渐增大,进而出现重叠生长。2周后细胞间可见圆形或卵圆形的钙化结节,结节周围细胞呈放射状分布。碱性磷酸酶染色阳性,Von Kossa法检测出钙化结节。体外单层培养的软骨细胞呈球形,悬浮在培养液中,5h后开始贴壁,细胞呈扁平状,大多数三角形,少量多角形,约1周细胞铺满培养瓶,呈“铺路石”样。第2、3代细胞S—100免疫细胞化学染色胞浆内呈阳性反应。2.细胞/支架光镜下观察:细胞悬液滴加于经预湿处理的复合支架材料上,支架材料迅速膨胀,证明细胞扩散到支架内。接种24h后,倒置显微镜下见材料不透明,无法观察其内细胞生长情况,但可见大量成骨细胞或软骨细胞贴附在材料旁培养板内。3.MTT检测:成骨细胞和材料复合后,除第1天两组之间无显著性差异外(P=0.706),其余时间点两组之间有显著性差异(P＜0.05),模拟微重力组明显比培养板组细胞增殖力高。两组之间整体比较也有统计学意义(P=0.000),证明模拟微重力对成骨细胞在修复体内的增殖比普通培养起到了更好的促进作用。软骨细胞和材料复合后,不同时间点两组之间有显著性差异(P＜0.05),模拟微重力组明显比培养板组细胞增殖力高。两组之间整体比较也有统计学意义(P=0.000),证明模拟微重力对软骨细胞在修复体内增殖比普通培养起到了更好的促进作用。4.扫描电镜:培养7d后,细胞成团地吸附于修复体表面及孔隙侧壁,并可见细胞间通过突起相互连接,或伸出伪足贴附于支架孔隙壁上;从复合支架材料中间切开,普通培养组见其内部有少量细胞贴附于孔隙侧壁,模拟微重力组则可见到大量细胞,细胞数量比普通培养组明显增多。5.HE染色和免疫组化结果:成骨细胞和材料:4周后,材料表面可见大量细胞,内部可见部分细胞聚集成团;细胞呈长梭形,细胞团中有基质分泌,沉积于细胞周围;Ⅰ型胶原免疫组织化学染色示胞浆内呈阳性反应。软骨细胞和材料:4周后,材料表面可见大量细胞黏附成层状,内部亦可见细胞聚集成团;细胞呈圆形或椭圆形,细胞团中有基质分泌,沉积于细胞周围,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示胞浆内呈阳性反应。普通培养组的细胞多聚集在修复体表面,细胞数量明显多于修复体内部,而模拟微重力组材料表面和材料内部细胞数量相差不大,内部细胞数量明显比普通培养组多。结论1.成功培养出兔原代软骨细胞和BMSCs,并成功诱导BMSCs为成骨细胞,为进一步的细胞和材料的接种提供了数量充足和生物学性能良好的种子细胞。2.胶原/壳聚糖/β-TCP层状梯度复合体模拟了正常关节软骨分层结构,细胞相容性好,能提供细胞生长的三维环境。3.转壁式旋转培养仪产生的模拟微重力可以使软骨细胞和成骨细胞在修复体内高密度生长,能更好的促进细胞增殖和细胞外基质分泌,提高了组织工程化关节软骨体外培养的质量,为关节软骨组织工程的研究开辟了新的道路。