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[目 的]前列腺癌是老年男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤。世界范围内,前列腺癌发病率居男性全身恶性肿瘤第2位。近年来,我国前列腺癌的发病率呈快速增长趋势,对我国老年男性的健康水平造成了极大的威胁。与此同时由于我国前列腺癌早期筛查体系的相对欠缺,前列腺癌首诊患者中约60%为预后不良的进展性和转移性中晚期前列腺癌,显著高于欧美国家的16%。对于中晚期失去局部治疗机会的患者,去势联合抗雄的全雄阻断为临床推荐的一线治疗方案,该方案对约80-90%的患者有效。但多数患者在用药1-2年后,会出现耐药且前列腺特异性抗原（prostate specific antigen,PSA）再度上升,最终进展为去势抵抗性前列腺癌（castration resistant prostate cancer,CRPC）的情况,预后多不良。近年来随着前列腺癌基础研究及临床诊疗探索取得的巨大进展,新的内分泌治疗药物如恩杂鲁胺和阿比特龙等逐渐在临床应用后,在一定程度上改善了CRPC患者的预后,但这些治疗效果仍较有限,仅能延长患者数月的生存时间。故进一步寻找治疗前列腺癌,尤其是针对CRPC的有效方法是近年的研究热点。从中药中分离提取天然化合物是药物的重要来源之一。重楼属植物以根茎入药,在我国传统医学中具有抗肿瘤、消炎、止血、抗氧化、保护血管内皮细胞等药理作用。长柱重楼P.forrestii（Takht.）H.Li为云南特有的可人工栽培的重楼属植物,长柱重楼总皂苷（PCT3）作为其根茎主要活性成分,研究发现PCT3对于脑瘤细胞,白血病细胞,恶性淋巴瘤细胞均有不同程度的抑制作用。但在治疗前列腺癌方面,PCT3的药理作用及分子机制尚未完全明确。本课题拟在细胞及动物水平,结合分子生物学实验,转录组高通量测序等方法,围绕PCT3对前列腺癌的抑癌作用及分子机制展开研究。[方法]在课题第一部分中,我们在体外细胞实验中明确PCT3对前列腺癌细胞生物学行为的影响。包括采用CCK8法,比较PCT3及其它具有抗癌活性的重楼皂苷单体对前列腺正常上皮细胞RWPE,前列腺癌细胞LNCAP,PC3,DU145增殖能力抑制作用的差异;通过CCK8,EdU,克隆成型实验检测不同浓度的PCT3作用于前列腺癌细胞不同时间后对细胞增殖的抑制作用;划痕实验,transwell侵袭实验探究药物对细胞侵袭转移能力的抑制作用;流式细胞术,western blot技术评估PCT3诱导前列腺癌细胞发生凋亡的情况;在课题第二部分中,我们通过高通量测序技术,对PCT3发挥抑制前列腺癌作用的潜在作用靶基因进行筛选。通过RNA表达谱芯片检测PCT3作用于前列腺癌细胞LNCAP、PC3前后细胞内lncRNAs和mRNAs的表达变化情况,并筛选表达显著差异的lncRNAs和mRNAs。通过比对KEGG,GO数据库,对差异基因进行细胞信号通路富集分析及细胞功能富集分析。最后采用RT-PCR对PCT3作用后两株细胞内芯片提示的表达均显著变化的lncRNAs和mRNAs进行验证;在课题第三部分中,我们基于以上结果,初步锁定了 PCT3抑制前列腺癌的潜在作用靶基因IQGAP3,进一步在体内及体外实验中探究PCT3对前列腺癌细胞内IQGAP3蛋白表达的下调与其抑制前列腺癌作用的相关性及其具体分子机制。采用慢病毒转染构建过表达IQGAP3的前列腺癌细胞系LNCAP-IQGAP3,PC3-IQGAP3,采用PCR及western blot验证转染效率。应用PCT3处理母细胞系及过表达细胞系后,CCK8,克隆成型检测药物作用前后细胞增殖的抑制情况;划痕实验,transwell侵袭实验检测药物作用前后细胞侵袭转移的抑制情况。体内实验中,应用PC3,PC3-IQGAP3在BALB/C裸鼠上构建前列腺癌细胞皮下种植成瘤模型,观察PCT3瘤内注射后瘤体增长的变化情况。最终采用western blot对PCT3作用后前列腺细胞内ERK信号通路蛋白及EMT相关蛋白进行检测,探究PCT3下调IQGAP3进而抑制前列腺癌细胞的具体分子机制。[结果]在第一部分中,结果表明PCT3对于前列腺癌细胞展现出与其它已报道有抗肿瘤活性的重楼皂苷单体相似的抑癌作用,同时其对正常前列腺上皮细胞的毒性弱于其它重楼皂苷单体;细胞生物学功能实验结果表明,4μg/mL以上浓度的PCT3可显著抑制前列腺癌细胞LNCAP,PC3的增殖能力,2μg/mL以上浓度的PCT3可显著抑制细胞的迁移,侵袭能力,4μg/mL以上浓度的PCT3可显著诱导前列腺癌细胞发生凋亡。在第二部分中,通过RNA表达谱芯片检测,PCT3作用后,LNCAP细胞中我们发现了 172个mRNAs及98个lncRNAs表达发生了显著的变化;在PC3细胞中我们发现了 1321个mRNAs及251个lncRNAs表达发生了显著的变化。通过比对KEGG数据库及GO分析,PCT3作用后前列腺癌细胞表达显著变化的基因最多富集在细胞凋亡、药物应答、细胞增殖负调控、细胞周期、DNA复制相关的细胞功能及信号通路;最终,我们将两株细胞药物作用后的差异基因取交集,我们确定了 41个mRNAs及5个lncRNAs在PCT3处理后表达在两株细胞中均显著发生变化。通过RT-PCR验证,我们验证了 PCT3作用于不同前列腺癌细胞后基因表达变化与测序结果一致的mRNAs和lncRNAs,初步筛选出了 PCT3发挥抑制前列腺癌作用的潜在靶基因:在第三部分中,体外细胞实验及裸鼠成瘤实验结果表明PCT3下调前列腺癌细胞中IQGAP3的表达可能与其抑制激素抵抗前列腺癌细胞的增殖及侵袭转移作用相关,与抑制激素敏感前列腺癌细胞的作用无明显关系。Western blot对信号通路蛋白检测结果显示,PCT3通过下调IQGAP3抑制激素抵抗前列腺癌细胞增殖可能与调控ERK/AKT信号通路相关;PCT3通过下调IQGAP3抑制激素抵抗前列腺癌细胞迁移侵袭可能与调控细胞EMT相关。[结论]本课题明确了较低浓度的PCT3对前列腺癌细胞增殖侵袭转移有显著的抑制作用,并可以显著诱导细胞发生凋亡;通过高通量测序技术,明确了药物对前列腺癌细胞内mRNAs和lncRNAs表达的调控,筛选了其潜在的药物作用靶基因;最终证明了 PCT3可通过下调IQGAP3的表达抑制激素抵抗前列腺癌增殖、侵袭及转移的作用且该作用与调控细胞内ERK/AKT信号通路及细胞EMT相关。本课题为PCT3作为前列腺癌治疗的方式提供了理论基础,并为前列腺癌的治疗探索了新的治疗靶点。