前言BMP7(Bone Morphogenetic Protein,骨形成蛋白7)是BMP家族成员之一,其的主要功能是在胚胎发育中参与调节各胚层细胞的增值、分化、迁移等生理过程以及在出生以后参与骨骼的发育和诱导异位骨形成。近年的研究发现它在肿瘤发生发展中也发挥了重要作用。Alarmo EL等在三个高表达BMP7(BT-474、MCF-7、SK-BR-3)和五个不表达(MDA-MB-231、ZR-75-30)或低表达BMP7(HCC-1954、MDA-MB-361、T-47D)的乳腺癌细胞系中,分别通过RNAi和外源性加药两种途径研究了BMP7对乳腺癌细胞增殖的影响。结果发现,虽然内源性和外源性BMP7分别在BT-474和MDA-MB-231细胞系均表现出促进了细胞的增殖的作用,但是它们促进细胞增殖的机制却完全不同。内源性BMP7是通过促进细胞由G1期细胞进入S期来促进细胞的增殖,而外源性BMP7则是通过抑制细胞凋亡来促进细胞的增殖。更有趣的是,在五个不表达或低表达BMP7的细胞系中,外源性BMP7表现出促进MDA-MB-231细胞系增殖和抑制ZR-75-30、HCC-1954、MDA-MB-361、T-47D细胞系增殖的双重作用。由此可见,BMP7可以通过多种途径影响肿瘤细胞的增殖。BMPs受体分为Ⅰ型和Ⅱ型,其中Ⅰ型受体决定了信号传递的特异性。Ⅰ型受体包括BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A三个亚型,但是这三种亚型在信号传递过程中的作用机制目前尚未明确。我们推测,BMP7对肿瘤细胞的增殖、凋亡和迁移侵袭能力的不同影响很有可能与参与BMP7信号传递的Ⅰ型受体的类型有关。为了证实这个的推测,我们检测了3种非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系和人支气管上皮细胞系(HBE)中BMP7及其1型受体的表达情况,并分析了其表达水平与肺癌的恶性程度和侵袭转移能力之间的关系。从中筛择出同时表达三种受体的肺大细胞癌NCI-H460细胞系作为研究对象。随后,我们检测了外源性hBMP7对肺大细胞肺癌细胞NCI-H460增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。最后我们在NCI-H460细胞中通过特异性抗体分别阻断不同的1型受体,研究hBMP7处理后细胞增殖能力的改变,探讨了不同的Ⅰ型受体在BMP7信号传导过程中的作用机制。材料和方法一、细胞株和试剂肺腺癌A549、LTE,肺鳞癌SPC和肺大细胞癌NCI-H460细胞株购自;DMEM培养基购自美国GIBCOBRL公司;鼠单克隆抗人BMP7、BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A抗体均购自Santa Cruz公司;兔多克隆抗人β-actin抗体由北京中杉金桥生物技术公司分装;山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术公司;RT-PCR试剂盒购自Takara公司。二、细胞培养肺腺癌细胞A549在含10%胎牛血清的DMEM培养液中贴壁生长;人支气管上皮细胞HBE在含15%胎牛血清的RPMI-1640培养液中贴壁生长;NCL-NCI-H460、SPC-A-1、LTEP-a-2在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中贴壁生长,均在37℃,5%CO2条件下培养。三、RT-PCR提取细胞总RNA,按RT-PCR(TaKaRa)试剂盒方法进行逆转录反应,反应体系为20μL,取2μL的RT产物进行PCR反应,反应体系为20μL。PCR产物琼脂糖凝胶电泳进行检测,采用凝胶成像分析系统进行半定量分析。四、SDS-PAGE电泳和Western Blot提取细胞总蛋白。电泳、转印,小牛血清封闭后加入相应的一抗、二抗,DAB显色。结果判定为转印膜上出现灰色条带,并对条带进行灰度值测定。五、生长曲线测定(MTT)以10~3个细胞/孔的密度,将细胞接种于96孔细胞培养板内,置于细胞培养箱内培养,每过24h每组各取6孔细胞检测增殖情况。每孔内加入20μlMTT溶液,150μlDMSO,在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。六、流式细胞仪检测凋亡收集细胞,洗涤细胞,用1×binding buffer悬浮细胞,使其密度为1×10~6/ml左右,再用Annexin V标记液轻轻重悬细胞,每10~5～10~6细胞100ul孵育液。在暗处,室温中孵育15分钟,再在每份标本加10ulPI,每100ul孵育混合液中加预冷400ul的1×binding buffer稀释,在15分钟内进行流式检测。七、细胞迁移和侵袭能力检测上室中加入100μl无血清RPMI-1640培养基(孔径8μm,Costar,USA),细胞数为2。5×10~4个,下室加入600μl含10%胎牛血清RPMI-1640培养基。37℃、5%CO2孵箱中培养6hr后吸尽培养基,固定染色,镜下观察。八、统计学分析应用SPSS+13.0统计分析软件,细胞实验结果采用t检验进行数据分析,用mean±SD表示,P＜0.05为有统计学意义。结果一、BMP7在3种NSCLC细胞系和HBE细胞系中的表达情况应用RT-PCR和Western blot方法检测的结果显示BMP7在人正常支气管上皮细胞系HBE中表达最多,在两个肺腺癌细胞系A549、LTE中及一个肺大细胞癌细胞系NCI-H460中表达依次减少。二、BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A在3种NSCLC细胞系和HBE细胞系中的表达情况应用RT-PCR和Western blot方法检测的结果显示BMPR1A在各细胞系中均有表达。BMPR1B在LTE、A549、NCI-H460三种细胞系中有表达而在HBE细胞系中不表达。而ACVR1A则仅在NCI-H460一种细胞系中有表达,在其它三种细胞系中均无表达。这说明不同的Ⅰ型受体在细胞系中的表达具有选择性,BMPR1B和ACVR1A仅在肺癌细胞系中有表达而在正常支气管上皮细胞系无表达。三、外源性BMP7对肺大细胞癌NCI-H460细胞增殖的影响MTT法检测细胞增殖的结果显示加入BMP7后细胞增殖能力受到明显抑制,差异具有统计学意义(P＜0.05)。四、特异性抗体分别阻断BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A后BMP7对NCI-H460细胞增殖的影响MTT法检测细胞增殖的结果显示与阴性对照组相比,anti-BMPR1A、anti-BMPR1B和anti-BMPR1A+anti-BMPR1B阻断组BMP7对细胞增殖的抑制能力明显减弱,差异具有统计学意义(P=0.003、0.014、0.000),其中anti-BMPR1A+anti-BMPR1B阻断组BMP7对细胞增殖的抑制能力几乎减弱至0。而anti-ACVR1A阻断组BMP7对细胞增殖的抑制能力减弱不明显,不具有统计学意义(P=0.074)。五、外源性BMP7对肺大细胞癌NCI-H460细胞迁移、侵袭能力的影响基质胶侵袭实验的结果显示,BMP7处理组细胞穿透数目(7.875±2.9),与正常对照组(32.66667±5.094348)相比减少了75.0%,差异有统计学意义(P＜0.001)(图6,A、C)。迁移实验结果显示,BMP7处理组细胞穿透数目(18±3.295)与正常对照组(47.375±5.579)相比减少了61.7%,差异有统计学意义(P＜0.001)。(图6,B、D)六、外源性BMP7对肺大细胞癌NCI-H460细胞凋亡的影响流式细胞仪检测BMP7处理前后细胞凋亡的结果显示,正常NCI-H460细胞凋亡率为3.11%±0.61%,而外源性BMP7处理组细胞凋亡率为3.6%±0.75%,差异无统计学意义(P=0.07)结论1、在人高转移性肺大细胞癌细胞系NCI-H460中外源性BMP7具有抑制细胞增殖、迁移和侵袭的作用。2、BMP7通过激活BMPRⅠA、BMPRⅠB两种Ⅰ型受体共同发挥抑制NCI-H460细胞增殖的作用。