【摘 要】
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菜籽饼粕中含有大量的硫代葡萄糖苷（硫苷）,不仅严重影响了其作为饲料的适口性,而且摄入过多还容易造成动物中毒,大大制约了菜籽饼粕作为饲料的发展与利用。然而,硫苷作为植物体内的次级代谢产物,又是植物防御体系的重要组成部分,在植物抵抗真菌、细菌、微生物、昆虫和软体动物的过程中都发挥了极其重要的作用。由于拟南芥等十字花科种子中积累的硫苷是从植物营养体中通过GTR1、GTR2蛋白转运而来,因此,本实验中利用
【基金项目】
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江苏省自然科学基金（编号:BK20190894）; 国家自然科学基金（编号:31901504）
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菜籽饼粕中含有大量的硫代葡萄糖苷（硫苷）,不仅严重影响了其作为饲料的适口性,而且摄入过多还容易造成动物中毒,大大制约了菜籽饼粕作为饲料的发展与利用。然而,硫苷作为植物体内的次级代谢产物,又是植物防御体系的重要组成部分,在植物抵抗真菌、细菌、微生物、昆虫和软体动物的过程中都发挥了极其重要的作用。由于拟南芥等十字花科种子中积累的硫苷是从植物营养体中通过GTR1、GTR2蛋白转运而来,因此,本实验中利用了 CRISPR系统针对BnaGTR1、BnaGTR2构建基因敲除载体,期望通过这一方法创造出营养体高硫苷、种子低/无硫苷的甘蓝型油菜新种质。近年的研究中显示甘蓝型油菜的基因编辑效率明显低于拟南芥、水稻等植物。推测原因可能是由于甘蓝型油菜基因含有多个拷贝、具有更复杂的基因组,或者是由于CRISPR系统没有针对甘蓝型油菜进行系统的改良所致。为此,本研究通过筛选在油菜遗传转化过程中表达水平较高的基因,并利用该基因的启动子替换CRISPR/Cas9系统中驱动Cas9蛋白的启动子,期望利用此方法去提高CRISPR/Cas9系统中Cas9的表达水平,从而提高CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率。主要研究成果如下:（1）本研究选择了 5种种子硫苷含量较高的油菜品种/品系进行外植体再生能力的测试,结果发现“A109”、“GRG1387”品种在组织培养过程中虽然能长出愈伤,但再生苗分化效率低,只有1.32%以及1.67%,不能应用于油菜的遗传转化;而“宁油 10 号”、“Wesreo”、“19wy048”的外植体再生效率为 19.27%、49.65%、64.42%,可以尝试进行油菜遗传转化。（2）对BnaGTR1以及BnaGTR2进行生物信息学分析发现,在甘蓝型油菜中BnaGTR1有6个拷贝,BnaGTR2有8个拷贝。基因表达数据库分析表明BnaGTR1以及BnaGTR2基因分别有3个拷贝在种皮中表达水平较高,被作为基因编辑的候选基因。针对在种皮中高表达的BnaGTR1以及BnaGTR2的3个拷贝分别设计4个靶位点,并构建CRISPR/Cas9基因敲除载体。（3）以“宁油10号”、“Wesreo”、“19wy048”为油菜转基因受体进行油菜遗传转化,成功获得了转基因苗共37株,其中靶向BnaGTR1基因的植株30个,靶向BnaGTR2基因的植株7株。但以“宁油10号”为遗传背景的转基因未获得抗性植株,说明该品种不适用于遗传转化或不适用于本研究中的方法。（4）对转基因植株的序列分析发现,CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑效率在3.3%-42.8%之间;在2个T0植株中检测到双重或三重突变,但未检测到纯合突变。对部分T1代植株进行分析发现,T0代中检测到的基因编辑事件是可遗传的;而且在T0代中未介导基因编辑的sgRNA可能在T1代植株生长发育过程中持续发挥功能,从而使后代中出现更多新的突变类型。在T1代植株出现了相对较高的基因编辑效率,可检测到纯合突变、多重突变的类型。（5）对油菜组织培养过程中的材料取样并分析转录组,筛选了 11个表达水平较高的基因启动子作为候选。对这些启动子的表达模式进行分析后发现,PPIase、MT2-4、MT2-22、GAPC2等基因在组织培养过程中,以及茎尖分生组织中的表达水平与内参基因Ubc9相当,或高于Ubc9数倍至数十倍。综合各基因表达水平和表达模式,我们选择PPIase和MT2-22的启动子用于CRISPR/Cas9系统改造。但PPIase基因的启动子未能成功克隆,本研究将MT2-22的启动子替换系统原有的35S启动子并构建CRISPR/Cas9系统载体。在新载体进行遗传转化中,检测愈伤组织中Cas9表达水平发现,MT2-22启动子驱动下比35S驱动下Cas9的表达水平提高了数百倍,说明这个启动子在组织培养过程中可以大大提高Cas9的表达丰度。
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