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猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)感染引起的猪的一种慢性呼吸道传染病。灭活疫苗接种是目前控制该病最主要的策略,但这种疫苗免疫保护效果有限,也不能阻断病原在呼吸道的定殖及病原在猪群内和猪群之间的传播。因此,迫切需要开发新一代更加有效的疫苗。疫苗制备的核心之一是筛选具有良好免疫保护效果的抗原。本实验室已经建立了猪肺炎支原体血清体液免疫显性蛋白抗原的筛选方法和区分高免血清与恢复期血清体液免疫显性蛋白抗原的方法,能大规模筛选血清体液免疫显性蛋白抗原。因此,本研究在优化前期已经建立的区分高免血清与恢复期血清的血清体液免疫显性蛋白抗原方法的基础上,筛选血清体液免疫显性蛋白和区分高免血清与恢复期血清的血清体液免疫显性蛋白抗原,为猪肺炎支原体保护性抗原的筛选提供候选蛋白抗原。1.区分猪肺炎支原体高免血清与恢复期血清的血清体液免疫显性蛋白抗原ELISA方法的优化目的:优化本实验室前期建立的区分猪肺炎支原体高免血清与恢复期血清的血清体液免疫显性蛋白抗原ELISA方法。方法:将GST-Mhp366重组菌和GST工程菌裂解液加入谷胱甘肽包被板进行抗原包被,分别与9份Mhp高免血清和15份Mhp恢复期血清反应,对抗原包被量、封闭液、血清(Mhp高免血清和Mhp恢复期血清)和二抗稀释度进行优化。结果:确定5倍稀释的GST-Mhp366重组菌和GST工程菌裂解液为抗原的最佳包被浓度,PBS+10%NBS+2.5%脱脂奶粉为最佳封闭液,分别将血清按照1:500、HRP标记兔抗猪Ig G酶标二抗按照1:40 000稀释为最佳血清稀释度和二抗工作浓度。结论:确定了更加精确的筛选区分猪肺炎支原体高免血清与恢复期血清的血清体液免疫显性蛋白抗原ELISA方法的参数。用此方法筛选出的蛋白命名为区分性体液免疫显性蛋白。2.部分猪肺炎支原体蛋白抗原的原核可溶性表达目的:将部分猪肺炎支原体蛋白进行原核可溶性表达。方法:选择24个普遍存在于Mhp菌株中的保守蛋白,相应的基因由生物公司合成。合成过程中将编码色氨酸的TGA密码子修改为TGG。其中mhp067和mhp565基因片段过长,将其分成五段后合成。合成的mhp246和mhp353基因设计引物扩增基因片段,扩增的片段命名为mhp246-N、mhp246-C、mhp353-C。将mhp024、mhp067-1、mhp067-4、mhp067-5、mhp144、mhp170、mhp246-N、mhp274、mhp275、mhp303、mhp326、mhp347、mhp353-C、mhp354、mhp435、mhp440、mhp444、mhp460、mhp482、mhp520、mhp565-1、mhp565-2、mhp565-4、mhp565-5、mhp641和mhp681连接p GEX-6P-1载体,mhp246-C、mhp263、mhp586连接p GEX-4T-3载体,mhp067-3、mhp320连接p GEX-5X-3载体,mhp067-2、mhp565-3、mhp586基因连接p GEX-6P-2载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌XL-1 Blue感受态细胞原核可溶性表达。表达的蛋白经初步纯化后验证能否被Pre Scission protease酶酶切。结果:所有33个Mhp蛋白均成功以可溶性形式表达,Mhp067-4、Mhp144、Mhp275、Mhp520、Mhp565-2、Mhp565-5和Mhp681能被Pre Scission protease酶酶切。结论:成功原核可溶性表达33个Mhp蛋白,为血清体液免疫显性蛋白筛选提供了材料。3.猪肺炎支原体血清体液免疫显性蛋白抗原的筛选鉴定目的:从原核可溶性表达的33个Mhp蛋白中筛选出血清体液免疫显性蛋白。方法:用诱导表达目的蛋白的33个重组菌裂解液和GST工程菌裂解液原液包被谷胱甘肽板,PBS+10%NBS+2.5%脱脂奶粉封闭,分别将血清(7份Mhp阴性血清和11份Mhp恢复期血清)按照1:500稀释、HRP标记兔抗猪Ig G酶标二抗按照1:40 000稀释,进行ELISA反应。结果:共筛选出21个Mhp血清体液免疫显性蛋白抗原,分别为Mhp067-1、Mhp067-4、Mhp144、Mhp170、Mhp246-N、Mhp263、Mhp274、Mhp275、Mhp303、Mhp347、Mhp354、Mhp440、Mhp444、Mhp460、Mhp482、Mhp520、Mhp565-1、Mhp565-2、Mhp565-5、Mhp641和Mhp681。结论:从33个Mhp蛋白中筛选出21个血清体液免疫显性蛋白抗原。4.区分性血清体液免疫显性蛋白抗原的筛选鉴定目的:从21个血清体液免疫显性蛋白中筛选出不与Mhp高免血清反应而只与恢复期血清反应的血清体液免疫显性蛋白抗原。方法:1:5倍稀释21个Mhp血清体液免疫显性蛋白重组菌裂解液和GST工程菌裂解液包被谷胱甘肽板,PBS+10%NBS+2.5%脱脂奶粉进行封闭,分别将血清(7份Mhp高免血清和11份Mhp恢复期血清)按照1:500稀释、HRP标记兔抗猪Ig G酶标二抗按照1:40 000稀释,进行ELISA反应。结果:共筛选出6个不与Mhp高免血清反应而只与恢复期血清反应的血清体液免疫显性蛋白抗原,分别是Mhp067-4、Mhp170、Mhp275、Mhp347、Mhp444和Mhp565-2。结论:筛选出6个区分猪肺炎支原体高免血清与恢复期血清的血清体液免疫显性蛋白抗原。