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目的:明确RhoA/ROCK1信号通路对骨髓干细胞(Bone marrow stem cells BMSCs)向肝细胞诱导分化的影响,为BMSCs肝向分化的调控机制提供一个新的切入靶点,也为临床更好的应用BMSCs移植治疗肝硬化提供理论依据。方法:1.构建pcDNA3.1(+)-RhoA,pLVX-shRNA1-RhoA载体,通过Lipofectamine?2000转染入BMSCs。体外培养BMSCs,进行分组:BMSCs细胞组(正常对照组)、pcDNA3.1(+)-HK组(过表达RhoA空载体组)、pcDNA3.1(+)-RhoA组(过表达RhoA组)、pLVX-shRNA1-HK组(沉默RhoA空载体组)、pLVX-shRNA1-RhoA组(沉默RhoA组)。2.细胞转染后,每组加入20ng/ml浓度的肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor HGF)体外诱导培养,运用MTT法检测细胞的增殖情况,绘制细胞生长曲线。用免疫荧光法检测各组BMSCs中肝细胞特异蛋白甲胎蛋白(AFP)的表达情况。Western blot技术检测各组BMSCs的相关蛋白RhoA、ROCK1和磷酸化肌球蛋白轻链(Phosphorylated myosin light chain p-MLC)在分化过中的表达情况。结果:1.细胞形态学变化。转染后第7天,pLVX-shRNA1-RhoA组出现上皮样细胞,可见部分细胞呈扁平形或三角形。BMSCs组、pcDNA3.1(+)-HK组、pLVX-shRNA1-HK组可见少量细胞呈不规则形,胞浆较前丰富,而pcDNA3.1(+)-RhoA组形态变化不明显,细胞呈梭形排列。2.各组BMSCs增殖情况。培养3d后,各组BMSCs的OD值均有所上升,其中pLVX-shRNA1-RhoA组OD值开始上升,高于其它组。pcDNA3.1(+)-RhoA组OD值则小于其它组。pcDNA3.1(+)-RhoA组在3d、5d、7d的OD值与BMSCs细胞组、pcDNA3.1(+)-HK组、pLVX-shRNA1-HK组、pLVX-shRNA1-RhoA组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。pLVX-shRNA1-RhoA组在3d、5d、7d的OD值与BMSCs细胞组、pcDNA3.1(+)-HK组、pcDNA3.1(+)-RhoA组、pLVX-shRNA1-HK组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。3.各组BMSCs内RhoA/ROCK1通路相关蛋白表达情况。转染后3d后,各组之间比较,RhoA、ROCK1和p-MLC蛋白表达的差异无显著统计学统计意义(P>0.05)。转染7d后,pLVX-shRNA1-RhoA组与BMSCs组、pcDNA3.1(+)-HK组、pcDNA3.1(+)-RhoA组、pLVX-shRNA1-HK组相比,相关蛋白RhoA、ROCK1和p-MLC蛋白表达增加,差异有统计学意义(P<0.05),而pcDNA3.1(+)-RhoA与其他四组相比,相关蛋白RhoA、ROCK1和p-MLC表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。4.各组BMSCs免疫荧光蛋白表达情况。各组细胞诱导3d未见明显荧光信号,各组细胞诱导7d在荧光显微镜下细胞质中可见绿色荧光信号AFP的表达。pLVX-shRNA1-RhoA组与其他四组相比,AFP荧光强度较高,而pcDNA3.1(+)-RhoA组与其他四组相比,AFP荧光强度较弱。结论:1.抑制RhoA/ROCK1通路可促进BMSCs增殖并促进其肝向分化。2.过度激活RhoA/ROCK1通路可抑制BMSCs增殖并减少其向肝细胞分化。