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[目的]本研究以坐骨神经损伤(Sciatic Nerve Injury,SNI)为例,建立坐骨神经夹持损伤模型,研究周围神经损伤。基于行为学、形态学与分子生物学的综合评价,通过三法三穴推拿干预SNI模型大鼠,探究推拿对SNI模型大鼠脊髓运动神经元存活情况及小胶质细胞活化状态的影响,继而从脊髓神经再生抑制通路角度,观察推拿是否可以通过抑制Nogo-NgR信号通路中关键蛋白Nogo-A及NgR的表达,抑制生长锥回缩,促进轴突再生。通过研究三法三穴推拿干预促进神经元轴突再生,促进运动功能恢复的机理,探讨推拿治疗周围神经损伤的科学内涵,进而为临床周围神经损伤类疾病的推拿治疗提供理论基础。[方法]建立SNI模型大鼠,使用按摩推拿手法模拟仪,对殷门、承山、阳陵泉三穴进行定性定量点、拨、揉三法干预。运用坐骨神经功能指数评价大鼠的精细动作恢复情况,斜板试验评价大鼠的后肢肌力恢复情况。运用免疫荧光示踪观察脊髓运动神经元存活情况,荧光染色法观察小胶质细胞标记物CD11b的活化状态,以探究推拿对脊髓形态变化的影响;运用分子生物学技术检测脊髓腹角Nogo-A及NgR的表达情况。通过对行为学,形态学和分子生物学结果进行综合分析,评价推拿对SNI大鼠坐骨神经运动功能恢复的影响,并从脊髓神经活性物质形态变化和神经再生抑制通路角度探讨推拿的起效机制。[结果]1.推拿可以促进SNI大鼠运动功能的恢复1.1.坐骨神经功能指数(SFI)造模后7d,模型组SFI表现与假手术组相比显著降低(P<0.01)。干预第5d,与假手术组相比,模型组大鼠SFI表现显著降低(P<0.01)。干预第10d,与假手术组相比,模型组大鼠仍显著降低(P<0.01);推拿组与模型组相比有升高趋势(P<0.01),但仍低于假手术组。经推拿干预15d,推拿组大鼠比模型组显著升高(P<0.01),但仍低于假手术组。经推拿干预20d,模型组显著低于假手术组(P<0.01);而推拿组与模型组相比有显著升高(P<0.01),且已经接近假手术组水平。1.2.斜板试验造模后7d,模型组的斜板结果比假手术组显著降低(P<0.05)。干预第5d,模型组仍明显低于假手术组(P<0.05),且推拿组与模型组无显著性差异(P>0.05)。干预第10d,与模型组比较,推拿组大鼠斜板结果有升高趋势(P>0.05)。经推拿干预15d和20d时,模型组斜板结果仍明显低于假手术组(P<0.05);推拿组与模型组相比显著升高(P<0.05),且接近假手术组水平。2.推拿能改善SNI大鼠脊髄腹角神经元数量和小胶质细胞活化状态2.1.脊髓运动神经元免疫荧光示踪结果造模后7d,与假手术组相比,模型组损伤侧脊髓L4-L6节段荧光金逆行示踪神经元计数减少(P<0.05);干预20d后,与假手术组相比,模型组神经元计数显著减少(P<0.01),与模型组相比,推拿组神经元计数显著增多(P<0.05)。2.2.脊髓腹角小胶质细胞标记物CD11b的形态变化造模后7d,假手术组CD11b标记的小胶质细胞呈未活化状态,散在分布在脊髓腹角L4-L6节段;与假手术组相比,模型组损伤侧脊髓腹角L4-L6节段CD11b标记的小胶质细胞活化明显,聚集在运动神经元附近,与神经元密切接触;干预20d后,模型组脊髓腹角L4-L6节段CD11b标记的小胶质细胞呈明显的高活化状态,与模型组相比,推拿组小胶质细胞活化程度较弱。3.推拿可以通过降低脊髓腹角NgR的表达促进轴突再生脊髓腹角L4-L6节段Nogo-A及NgR蛋白Western-blot法和免疫组化法检测结果:Western-blot法检测结果显示:干预前(0d),与假手术组相比,模型组NogoA表达水平无显著性差异(P>0.05);干预20d后,与假手术组相比,模型组NogoA表达水平呈升高趋势(P>0.05),模型组与推拿组NogoA表达水平无显著性差异(P>0.05)。免疫组化法检测结果显示:干预Od,与假手术组相比,模型组NogoA表达水平无显著性差异(P>0.05);干预20d后,与假手术组相比,模型组NogoA表达水平呈升高趋势(P<0.05),模型组与推拿组NogoA表达水平无显著性差异(P>0.05)。Western-blot法检测结果显示:干预0d,与假手术组相比,模型组NgR表达水平升高(P<0.05);干预20d后,推拿组比模型组NgR表达水平降低(P<0.05)。免疫组化法检测结果显示:干预Od,与假手术组相比,模型组NgR表达水平升高(P<0.05);干预20d后,推拿组比模型组NgR表达水平降低(P<0.05)。[结论]1.三法三穴推拿干预可以促进SNI大鼠精细动作及后肢肌力的恢复,增加SNI大鼠脊髓腹角运动神经元的数量,降低脊髓腹角小胶质细胞的活化程度。证明推拿对神经纤维的恢复有促进作用,与小胶质细胞活化有关,为推拿治疗神经损伤类疾病提供行为学和形态学依据。2.三法三穴推拿干预可以降低脊髓腹角NgR的表达,说明推拿通过降低NgR在脊髓中的表达,阻止NogoA-NgR抑制信号的激活,进而起到促进轴突再生的作用,表明推拿治疗周围神经损伤的机制之一是抑制NogoA-NgR信号激活。