背景与目的脊髓神经元对缺血缺氧极其敏感,缺血损伤后即刻重新得到血液再灌注是防止使其死亡的必要措施,但近年却发现在某种损伤因子作用下,脊髓神经经过一定时间缺血,尽管得到了血液再灌注却出现了明显功能障碍,甚至出现不可逆性脊髓神经元迟发性死亡,这种现象称为脊髓缺血再灌注损伤。脊髓损伤后神经功能的保护和恢复对于医学界仍然是一大世界性难题,在过去的几十年,国内外广大科研工作者通过孜孜不倦努力,虽然没有彻底攻克它,但也取得了一些进展。脊髓损伤包括原发性和继发性,先已证明细胞凋亡是脊髓缺血再灌注损伤细胞死亡的主要方式。细胞凋亡是一种固有的自然生理过程,它通过清除死亡细胞和代谢产物维持人体各系统组织的稳定,而此过程不伴有局部炎症是其最大特点,有研究证实,不管是人类还是动物,脊髓缺血再灌注损伤中出现的神经元和神经胶质细胞死亡都是继发细胞凋亡的结果。细胞凋亡是一个复杂的病理生理过程,主要由Caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应完成,其中Caspase-3被认为是细胞凋亡过程的关键酶,Caspase-3的活化是细胞凋亡的早期生物化学指标,Caspase-3属于胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族,在凋亡执行阶段起核心作用。Caspase-3能剪切和活化Caspase-6、Caspase-7、Caspase-9。研究证实,Caspase-3介导了中枢神经系统损伤后的细胞凋亡,但是,关于Caspase-3的表达随时间变化特点及甲强龙对其影响的相关研究鲜有报导。有研究表明,通过药物干预脊髓继发性损伤病变过程可以起到减轻脊髓损伤,改善神经功能的作用,大剂量甲强龙治疗急性脊髓损伤在国际上已得到认可。甲基强的松龙(MethylprednisoloneMP)是美国FDA批准的唯一一个用于治疗脊髓损伤的药物。研究表明它能够通过抑制Caspase-3表达量的上调来发挥对脊髓神经细胞的保护作用。经过美国3次全国急性脊髓损伤研究,其标准治疗方案已经在世界各地广泛应用于急性脊髓损伤。但是临床上缺血再灌注脊髓损伤(spinal cord ischemic reperfusion injury SCII)非常多见,如严重的脊髓性颈椎病、胸椎管狭窄等手术减压术后都会导致脊髓缺血再灌注损伤。如果能够通过动物实验来探明在以上疾病手术时Caspase-3表达随时间变化特点及MP对其表达的影响,对于脊柱疾病的治疗将是个非常大的进步。本课题通过制作大鼠脊髓缺血再灌注损伤动物模型,观察脊髓损伤后6h、1d、3d、7d中Caspase-3的表达水平以及甲强龙预干预对其表达的影响,从而研究脊髓缺血再灌注损伤后Caspase-3对细胞凋亡的抑制。材料与方法1.动物模型制作和分组健康纯种成年雄性SD大鼠(郑州大学实验动物中心提供)120只,质量200±20g。随机分成3组：A组(正常组)40只大鼠；B组(SCⅡ组)40只大鼠,C组(MP组)40只大鼠。采用夹闭左右肾动脉间腹主动脉30分钟再灌注3个小时的方法制作SCⅡ模型；C组在脊髓缺血前30分钟给予MP剂量为30mg/kg,用生理盐水稀释至0.5ml从大鼠尾部静脉注射,B组给于相同剂量的生理盐水。2.标本取材每组实验动物分别6h、1d、3d、7d时麻醉,打开胸腔,从左心室插入静脉套管,快速灌注生理盐水,冲洗至流出的液体清亮,再灌注质量百分比为4%多聚甲醛,直至动物死亡,咬除T11、T12、L1棘突和椎板后,从圆锥开始向上取脊髓约1cm,常规甲醛固定,脱水,石蜡包埋,切片,HE染色和免疫组织化学染色。3.免疫组织化学染色和图像分析切片免疫组织化学染色后采用图像分析系统测量Caspase-3阳性染色物质吸光度,每张片随机选取6个不同视野,400高倍镜下用计算机计算出平均吸光度值A,A反应染色强度,代表Caspase-3相对含量。4.统计学处理用SPSS16.0统计分析软件处理实验数据,所有数据用均数加减标准差(x±s)表示,按α=0.05检验水准,采用单因素方差分析(ANOVA)三组之间的整体差异,采用LSD-t检验比较组间两两差异,P<0.05认为有统计学意义。结果1.大鼠脊髓缺血再灌注损伤后,损伤处有明显水肿、变性、坏死等病理变化。2.正常组脊髓内Caspase-3的表达量呈弱阳性,缺血再灌注组脊髓神经细胞内Caspase-3表达量明显增加。3.缺血再灌注组损伤前使用MP,脊髓的继发性损伤减轻,Caspase-3的表达量明显减弱,显示为弱阳性。4. Caspase-3的表达水平上,三组之间总体上差异有统计学意义(P<0.05),A组与B组差异性有统计学意义(P<0.05),B组与C组差异性有统计学意义(P<0.05),A组和C组差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.在缺血再灌注损伤前预防性使用MP可明显改善损伤脊髓的病理形态,表明脊髓缺血再灌注损伤前早期使用MP对损伤脊髓有一定的保护作用。2.正常脊髓神经细胞内Caspase-3的表达呈弱阳性,大鼠脊髓缺血再灌注损伤后脊髓神经细胞内Caspase-3的表达明显上调,而在脊髓损伤前使用MP可使大鼠脊髓神经细胞Caspase-3的表达显著降低。3.脊髓缺血再灌注损伤后第3天脊髓神经细胞内Caspase-3表达量最高,而后逐渐降低,第7天时显著降低。