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目的:探索自分泌运动因子(AMF)体外表达及获取方法,并观察AMF对大鼠神经植入术后终板再生及神经肌肉功能恢复的影响,为AMF深入研究和临床应用提供实验依据。方法:1、原代培养成年大鼠成肌细胞,并纯化扩增,为转染及进一步的实验做好准备。2、构建携带AMF及eGFP基因的FIV(慢病毒载体),双酶切,电泳鉴定载体连接结果。用慢病毒载体将AMF基因转染原代培养的成肌细胞,观察转染结果并统计转染阳性率。提取转染后阳性细胞的培养上清液,超滤离心浓缩后,凝胶层析纯化AMF并定量,用NIH-3T3细胞Transwell移动实验验证所获AMF的活性。3、建立大鼠腓肠肌失神经支配及神经植入术模型。实验组10只于植入术后第0天、7天、14天、21天、28天,将有活性的AMF按照50ng/只/周注射在神经植入处;对照组10只大鼠用相同的体积DF-12培养基于相同时间点进行相同部位注射。AMF注射后第8、16、24周,观察足迹测定胫神经功能指数;神经电生理技术检测每只大鼠手术侧复合肌肉动作电位(CMAP)的峰峰值(PPV)、曲线下面积(AUC),算出神经传导速度(NCV),除以对侧相应数据得出恢复率;病理组织学检查观察腓肠肌形态学改变并计数单位面积内终板数量。结果:1、经过2周的原代培养及纯化,可获得纯度为98.0%的成肌细胞。2、在转染复数(MOI)为100时,慢病毒载体转染成肌细胞可获得90.4%的阳性率,而转染后的AMF基因能正常表达。转染阳性细胞的培养上清液中的AMF作用于NIH-3T3细胞后,单位时间内穿过聚碳酸酯膜的细胞增多,证实转染后的成肌细胞表达了有活性的AMF。3、大鼠AMF注射完成后8、16、24周,电生理检测发现实验组胫神经传导速度、复合肌肉动作电位(CMAP)的峰峰值(PPV)和曲线下面积(Area)均显著高于对照组,神经传导速度(NCV)不具有统计学意义(P<0.05或P<0.001,详见表3-2);胫神经功能指数测定:实验组胫神经功能指数及标准化值显著高于对照组(P<0.05,详见表3-1);腓肠肌标本免疫化学染色证实:实验组的腓肠肌中,单位面积内终板的数量较对照组多,肌纤维HE染色未见组织有异型性倾向。结论:1、FIV慢病毒载体能以较高的效率将AMF基因转染到成肌细胞,而后者能表达有活性的目标蛋白(AMF)。2、活性AMF局部注射能使大鼠神经植入术后的神经肌肉功能恢复明显加快,再生终板数量增加,未见明显的副作用。