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马立克氏病(Mareks disease，MD)是由禽马立克氏病病毒引起的一种最常见的一种鸡淋巴组织增生性传染病，主要以外周神经和包括虹膜、皮肤在内的各种器官和组织的单核性细胞浸润为特征。本病是由一种疱疹病毒引起，传染性强，在病原学上与鸡的其他淋巴肿瘤病不同。MD存在于世界上所有养禽国家和地区，其危害随着养鸡业的集约化而增大，受害鸡群的损失从不到1％到超过30％不等，个别鸡群可达50％以上。感染除了引起鸡群的直接损害外，还造成严重的免疫抑制，生产力下降，混合感染，继发感染等，造成巨大的经济损失，严重危害养禽业的发展。在众多马立克氏病病毒的已鉴定的基因型中，目前有3个基因即132-BPR、PP38、MEQ基因猜测可能与致瘤有关。这其中，MEQ与132-BPR两个基因是MDV-1所特有，已证实毒株的体外致弱程度与132BPR的拷贝数目有相关关系，PP38则被证实为机体的免疫应答可被其抑制。MEQ基因由于有与致瘤基因jun/fos家族类似的分子结构，因此我们认为NEQ基因可能在MDV致病、致瘤中发挥重要的作用。而HVT（火鸡疱疹病毒）也具有MEQ基因，而其MEQ基因无论是致病性还是致瘤性都远远小于强毒株MEQ基因。基于这一发现，本研究表达了马立克氏病MEQ部分基因蛋白，并制备了多克隆抗体，为进一步研究马立克氏病病毒的基因功能提供技术支持;同时构建了pcDNA3.1-CVI988-MEQ、pcDNA3.1-RB1B-MEQ真核表达载体，进而通过荧光定量PCR的方法研究两种MEQ基因对宿主细胞因子表达的影响。 1.MEQ基因的原核表达及多克隆抗体的制备 设计马立克氏病毒MEQ基因前450个碱基的基因片段引物，应用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的片段，将目的基因与pGEM-T载体进行连接，构建含MEQ基因前450碱基的标准质粒pGEM-T-MEQ，将鉴定正确的pGEM-T-MEQ基因的重组质粒用目的酶酶切，再与pGEX-6p-1载体连接，构建并鉴定重组质粒pGEX-6p-1-MEQ。用传统的方法大量诱导表达pGEX-6p-1-MEQ重组菌。诱导的蛋白经GST蛋白纯化柱纯化后，按计划免疫6-8周龄BALB/c小鼠，分离小鼠血清得到抗马立克氏病毒MEQ蛋白的多克隆抗体。同时利用间接免疫荧光和Western blot对获得的多抗血清进行鉴定。 马立克氏病毒MEQ多克隆抗体的制备为进一步研究NEQ基因的生物学功能提供良好的生物材料。 2.疫苗株与强毒株MEQ基因对细胞因子表达影响 研究马立克氏病毒不同毒株MEQ蛋白对与细胞d然免疫相关的细胞因子表达水平的影响，本研究将CVI988-MEQ、RB1B-MEQ基因克隆到pcDNA3.1(+)中，构建真核表达载体pcDNA3.1-CVI988-MEQ、pcDNA3.1-RB1B-MEQ，并将构建好的质粒转染CEF细胞进行暂态表达。细胞转染24h后分别加入同一浓度的Poly(I∶C)刺激，在细胞刺激后6，12，24小时收集细胞提取RNA反转录成cDNA，利用Real-time PCR检测CEF细胞中炎性因子和抗病毒因子基因表达水平。结果分析显示转染RB1B MEQ组和CVI988 MEQ组相比，在6h时两组之间IL-6，TLR3，IFN-β，MDA5等炎性因子的表达量差异最为显著，随着时间延长，差异变化逐渐减弱。而TNF-α等其他细胞因子差异变化不明显。由此可以初步分析得知强毒株NEQ基因相比较在刺激d然免疫炎性因子的基因表达水平方面比弱毒株MEQ基因明显，从而进一步可以大胆猜测强毒株NEQ基因在病毒感染致肿瘤过程中可能发挥着重要作用。