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球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是一类应用广泛的生防真菌,在其生长发育及侵染昆虫过程中常有次生代谢物的合成,帮助真菌应对各类生物及非生物胁迫。课题组前期研究发现,球孢白僵菌在致死宿主后,会大量产生卵孢素,抑制死亡虫体上细菌的增殖,保证真菌生长所需的营养。卵孢素是一种红色聚酮类化合物,由一个含聚酮合成酶的基因簇（Op S）完成。Op S3是其中一个转录因子,直接调控基因簇中其它基因的表达。因此,探究Op S3的表达调控对弄清卵孢素的合成机制十分重要,但目前我们对卵孢素的合成机制却知之甚少。课题组前期对OpS3进行启动子分析,发现OpS3启动子中存在转录因子BbPacC和Bbmsn2的潜在结合位点。已有研究表明Bbmsn2能负调控卵孢素的合成,但Δmsn2菌株在不同p H条件下产卵孢素能力不同;BbPacC能与Op S3启动子相互作用并正调控卵孢素合成,但BbPacC超量表达菌株在低p H条件下仍然不能合成卵孢素（张雯雯,2018）。推测BbPacC与Bbmsn2可能共同调节的卵孢素的合成。本研究为探究上述两个调控蛋白在卵孢素合成调节中功能,构建了一系列的突变菌株,分析了两基因在不同人工培养条件及侵染昆虫过程中的潜在互作机制,获得的实验结果如下:1.BbPacC和Bbmsn2共同调控卵孢素的产生本研究通过基因敲除及超量表达手段分析BbPacC与Bbmsn2对Op S3的调控机制,构建了两个基因的单独敲除、超量以及双敲除、双超量突变体,包括msn2OE,Δmsn2,Pac COEmsn2OE,Pac COEΔmsn2,ΔPac CΔmsn2等5个菌株。⑴在液体培养条件下,正调控因子BbPacC与负调控因子Bbmsn2共同调节卵孢素合成将所获相关菌株在0.5×SDB液体培养3d,观察培养液颜色（卵孢素为红色）并分析卵孢素含量,发现以下规律:（1）在BbPacC缺失的条件下,各菌株均不能合成卵孢素,超量表达BbPacC能促进卵孢素合成,表明BbPacC为卵孢素合成的正调控因子;（2）在Bbmsn2缺失条件下,卵孢素合成增加,但超量表达Bbmsn2卵孢素合成较少,表明Bbmsn2为卵孢素合成负调控因子;（3）在野生型中超量表达BbPacC能增加卵孢素含量,但同时超量表达Bbmsn2则抑制了卵孢素合成;（4）在野生型中敲除Bbmsn2能提高卵孢素的产生,但同时缺失BbPacC的菌株则不能合成卵孢素。上述结果表明,BbPacC是卵孢素合成必需的正调控因子,其调控活性受到Bbmsn2的抑制,两者的共同作用决定在不同条件下卵孢素的合成差异。利用RT-PCR检测了上述条件下卵孢素合成关键酶基因OpS1及调控因子Op S3的表达。结果显示,上述两个基因的表达与培养基颜色深浅及卵孢素含量均呈正相关。⑵各菌株侵染死亡的大蜡螟虫尸上卵孢素的产生及相关基因表达使用不同菌株进行大蜡螟的侵染实验,不同菌株侵染后的虫尸上存在颜色差异,与卵孢素产量成正比。以野生型球孢白僵菌侵染的虫尸为正常对照,Pac COE、Δmsn2及Pac COEΔmsn2菌株侵染死亡的虫尸体色更红,卵孢素含量测定表明卵孢素产生更多,与液体培养结果相似。2.不同条件下卵孢素的合成主要取决于BbPacC和Bbmsn2的表达水平课题组前期研究发现,敲除锌指蛋白基因Bb Smr1负调控了卵孢素的合成。将野生型菌株和?Bbsmr1菌株在0.25×SDB培养基中培养3d后,分析BbPacC和Bbmsn2基因的表达水平。结果显示,敲除Bbsmr1没有显著改变BbPacC基因的表达,但显著降低了Bbmsn2的表达水平。因此,Bbsmr1负调控卵孢素合成的表型可能通过影响Bbmsn2的表达水平实现。此外,球孢白僵菌野生型菌株在高p H条件下更易产生卵孢素。表达分析也显示,在高p H条件下,BbPacC表达水平高,而Bbmsn2表达水平较低;但在低p H条件下,BbPacC表达水平较低,Bbmsn2表达水平较高。因此,两个基因表达水平差异是导致野生型菌株在高p H条件下大量合成卵孢素的原因。同时,我们分析了在野生型菌株致死大蜡螟后,不同时段的卵孢素相关基因表达变化。分别提取死亡后24h、48h、72h、96h的虫尸RNA,进行卵胞素合成关键基因Bb Op S1、Bb Smr1、BbPacC、Bbmsn2的表达量分析。实验结果显示,在昆虫死亡早期,负调控基因Bbsmr1及Bbmsn2表达水平均较低,而卵孢素合成基因Bb Op S1的表达较高;但在昆虫死亡48h后,Bbsmr1及Bbmsn2的表达水平显著升高,甚至高于卵孢素正调控基因BbPacC的表达水平,所以表现出卵孢素合成受到抑制。该结果正与我们前期观察到昆虫死亡早期卵孢素合成水平较高,随后逐渐降低的结果相吻合。3.BbPacC通过直接结合BbOpS3启动子对卵孢素进行正调控为证明BbPacC与Bbmsn2是否与卵孢素合成调控基因OpS3的启动子有直接结合,我们在大肠杆菌中异源表达了这两个蛋白。利用纯化的蛋白进行EMSA,但并未发现明显的结合现象。考虑到异源表达蛋白可能影响蛋白质的正确构象,我们利用球孢白僵菌的细胞破碎液进行EMSA。结果显示,超量表达BbPacC及野生型菌株均观察到与探针的结合,但敲除BbPacC菌株却没有观察到结合。该结果表明,BbPacC可以与Op S3启动子直接结合,从而调控其表达。综上所述,本研究探索了BbPacC及Bbmsn2对卵孢素合成的共同调节作用。BbPacC是卵孢素合成必需的正调控因子,通过与Op S3启动子直接结合对其进行正调控,其调控活性受到负调控基因Bbmsn2的抑制;同时Bb Smr1通过调节Bbmsn2的表达,负调控卵孢素合成。