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目的采用基因克隆技术构建MAGE-A3慢病毒过表达载体,感染人脐带血诱导培养的DC,检测其对MAGE-A3阳性表达的肿瘤细胞株的杀伤作用,探讨MAGE-A3基因修饰的DC介导的抗肿瘤效应。方法1.收集足月健康产妇脐带血,利用明胶沉淀红细胞,人淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,并用细胞因子(rhIL-4、rhGM-CSF)诱导单个核细胞分化为DC,通过倒置显微镜、常规切片和电镜观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面分子,混合淋巴细胞反应检测DC的功能,综合鉴定诱导的DC。2.应用基因克隆技术,RT-PCR扩增MAGE-A3基因全长cDNA序列,与慢病毒载体pGC-FU连接,构建MAGE-A3基因的慢病毒表达载体,通过PCR和基因测序鉴定。并进行滴度测定。3.将构建的MAGE-A3慢病毒载体感染未成熟DC,肿瘤坏死因子(rhTNF-α)诱导DC成熟,倒置荧光显微镜观察病毒感染效率,RT-PCR和Western blot检测MAGE-A3基因/蛋白的表达。筛选MAGE-A3阳性表达的人肿瘤细胞株,经修饰的DC诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)的扩增,用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)法检测特异性CTL对肿瘤细胞的杀伤作用。结果1.联合应用细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4及TNF-α从人脐带血中成功培养获得较多量的DC。DC形态不规则,细胞表面可见细小的突起;流式结果显示,未成熟DC(imDC)低表达细胞表面分子CD83、CD86、HLA-DR,成熟DC(mDC)上述细胞表面分子明显增高,CD83、CD86和HLA-DR分别达到55.21%、69.12%和93.53%;混合淋巴细胞反应结果显示,mDC较imDC对淋巴细胞的增殖刺激作用明显增强(P<0.05)。2.成功构建MAGE-A3慢病毒表达载体。琼脂糖凝胶电泳显示,重组慢病毒表达载体PCR扩增获得大小为988bp的片段,与需构建的MAGE-A3大小相符;经测序鉴定显示,测序结果与目标序列完全一致。MAGE-A3慢病毒载体滴度为2×108TU/ml。3. MAGE-A3慢病毒载体成功感染人脐带血来源的DC。倒置荧光显微镜观察,MAGE-A3慢病毒载体感染DC效率较高,感染12h即可见荧光表达,感染效率可达60%;提取感染后DC的mRNA及蛋白,RT-PCR和Western blot可检测到MAGE-A3基因和蛋白的表达;筛选出MAGE-A3阳性表达的胃癌细胞株SGC-7901和肝癌细胞株HUH-7;诱导后的CTL对SGC-7901和HUH-7的杀伤率达到(59.98±4.83)%和(70.1±14.4)%,明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05)。结论1.成功培养人脐带血DC,并优化大量获得DC的条件和鉴定方法。2.成功构建MAGE-A3慢病毒表达载体,获得较高滴度的慢病毒载体。3.经MAGE-A3慢病毒表达载体感染的DC在体外能够有效活化、扩增特异性CTL,对MAGE-A3阳性表达的肿瘤细胞株有较强的杀伤作用。4.本实验通过在体外观察MAGE-A3修饰的DC对肿瘤细胞的杀伤作用,对进一步的肿瘤免疫治疗研究奠定基础。