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PTEN是一个常见的肿瘤抑制因子,其磷酸酶活性能够对PIP3进行去磷酸化以抑制AKT的活性。PTEN-Long（PTEN-L）是PTEN的一个亚型,国内外多数文献报道其N端173个氨基酸（PTEN-L leader）具有潜在的分泌信号。与经典的PTEN不同的是,PTEN-L不仅能够从细胞中分泌出来,还能再次进入其它细胞内发挥PTEN蛋白的生物学活性。该特点可以应用于蛋白治疗临床疾病以代替传统的DNA或者RNA载体运输外源性基因进行基因治疗。在该研究中,我们将PTEN-L leader与另一个肿瘤抑制因子TP53嵌合,经过转录翻译后形成融合蛋白PTEN-L-p53。我们在已过表达PTEN-L-p53的HEK293T细胞的培养基中检测到该融合蛋白的存在,因此,PTEN-L-p53能够像PTEN-L一样从细胞内分泌出来。利用PTEN-L-p53的分泌性,我们采用超滤管对含有融合蛋白的培养基进行超滤浓缩（CFPCM）,然后把CFPCM加入U251细胞(TP53R273H,p53突变)中,进而显著地抑制了该细胞的活性。由于PTEN-L-p53基因中包含的PTEN-L leader和TP53都是内源性基因,只有两者之间可能产生一个新的抗原决定簇,能够显著地降低免疫源性问题。因此,PTEN-L-p53可以作为一个新的治疗性蛋白去治疗由TP53异常而诱发的肿瘤。目的1.确定PTEN-L-p53在HEK293T细胞中过表达。2.确定PTEN-L-p53进入受体细胞的能力。3.确定PTEN-L-p53能够像p53一样进入细胞内发挥生物学功能。4.证明实验室所保存的U251细胞中TP53的第273位氨基酸‘精氨酸’突变成‘组氨酸’。5.确定PTEN-L-p53抑制U251细胞的增殖与转移能力。方法首先构建pSecTag2 A-PTEN-L-p53、pcDNA3.1-TP53真核表达质粒,通过免疫印迹技术确定融合蛋白PTEN-L-p53及p53在HEK293T细胞中过表达。然后,采用Ni-NAT琼脂糖珠纯化已过表达PTEN-L-p53的HEK293T的细胞裂解物及其培养基,确定该PTEN-L-p53是否能够从细胞内分泌出来。通过免疫印迹技术检测PTEN-L-p53再次进入U251细胞的能力,结合核质分离技术将CFPCM加入HEK293T细胞中以确定该融合蛋白在细胞内的分布。我们选择U251细胞作为分子模型,在探究PTEN-L-p53的生物学功能前,先结合DNA测序确定实验室中保存的U251细胞表达一个内源性R273H突变的TP53(TP53R273H)。在U251细胞中转染TP53后,采用细胞计数,CCK8,划痕及Transwell等实验检测U251细胞的增殖与转移能力。以此为阳性对照,在U251细胞中过表达PTEN-L-p53蛋白,采用相同的方法检测融合蛋白对细胞的活力影响。最后,我们把含有PTEN-L-p53的CFPCM加入U251细胞中观察该融合蛋白对该细胞的活力影响。结果在本研究中,pSecTag2 A-PTEN-L-p53、pcDNA3.1-TP53质粒在HEK293T细胞中转染后,PTEN-L-p53及p53均能够被成功过表达。Ni-NAT琼脂糖珠在已过表达PTEN-L-p53的HEK293T细胞裂解物及培养基中均纯化出该融合蛋白,因此,PTEN-L-p53能从供体细胞中分泌出来。然后,CFPCM加入到U251细胞的培养基中,免疫印迹技术检测到PTEN-L-p53能够透过膜屏障再次进入U251细胞。HEK293T细胞被CFPCM处理后,我们对其进行核质分离,免疫印迹技术检测到PTEN-L-p53存在于细胞质及细胞核中,证明p53与PTEN-L leader融合之后并不影响融合蛋白进入细胞核内。DNA测序结果证明实验室保存的U251细胞表达了一个突变的TP53,它的第273位氨基酸‘精氨酸’突变成‘组氨酸’。以U251细胞为分子模型,过表达p53及PTEN-L-p53后显著地抑制它的增殖与转移能力。最后,将CFPCM加入到U251细胞的培养基中发现,PTEN-L-p53能够显著地抑制U251细胞的活力。结论1.PTEN-L leader能够携带p53进入受体细胞,并分布于细胞质及细胞核内。2.PTEN-L-p53抑制U251细胞的增殖与转移。