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目的本实验通过探索美洲大蠊抗肝纤维化活性部位(PA-B)对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)増殖、迁移、凋亡、胶原蛋白表达以及TGF-β1/Smad通路的影响,进一步探讨PA-B抗肝纤维化的作用机制,为美洲大蠊治疗肝纤维化提供实验基础。方法采用不同浓度PA-B作用于HSC-T6和LO-2细胞,MTT法检测PA-B对HSC-T6和LO-2细胞增殖的影响;采用划痕实验观察PA-B对HSC-T6细胞迁移的影响,以评价PA-B的细胞毒效应。采用Hoechst 33342荧光染色观察HSC-T6细胞凋亡形态变化,用流式细胞仪、激光共聚焦扫描显微镜同时检测线粒体膜电位的变化,同时采用Western blot法检测HSC-T6细胞中Bcl-2、Bax及Caspase-9凋亡蛋白表达,以评价PA-B对HSC-T6细胞凋亡的影响。采用免疫荧光法测定α-肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原蛋白(Col-I)、III型胶原蛋白(Col-III)的表达;免疫组化法和Western blot法检测TβRI、TβRII、Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad7蛋白表达;RT-q PCR检测TβRI、TβRII、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA的表达,以探讨PA-B对HSC-T6细胞胶原蛋白表达及TGF-β1/Smad通路的影响。结果1.PA-B对HSC-T6和LO-2细胞增殖的影响结果显示:与正常组比,PA-B可明显抑制HSC-T6细胞的增殖,且呈浓度和时间依赖性(P<0.05)。细胞迁移实验显示,与正常组比,PA-B干预HSC-T6细胞不同时间后,细胞迁移受到限制,迁移速度减慢。同时与正常组比,PA-B对LO-2无明显的抑制作用。2.PA-B对HSC-T6细胞凋亡的影响实验发现:PA-B能显著诱导HSC-T6细胞凋亡,且呈浓度依赖性(P<0.01)。PA-B能诱导细胞中线粒体去极化,膜电位下降,并且PA-B能促进线粒体凋亡途径中促凋亡蛋白Bax、Caspase-9蛋白的表达,同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达。3.PA-B对HSC-T6细胞蛋白表达的影响实验发现:α-SMA、Col-I和Col-III蛋白主要分布于细胞质上。与TGF-β1刺激组比,阻断剂LY-364947和PA-B能显著抑制α-SMA、Col-I、Col-III蛋白的表达,且呈浓度依赖性(P<0.05)。4.PA-B对TGF-β1/Smad信号通路的影响实验发现:RT-q PCR结果显示,与TGF-β1刺激组比,阻断剂LY-364947和PA-B均能显著降低HSC-T6细胞TβRI、TβRII、Smad2和Smad3 mRNA表达(P<0.01),并且能显著提高Smad7 mRNA表达(P<0.01)。免疫组化结果显示TβRI、TβRII、Smad7蛋白主要表达于细胞质内,而Smad2、Smad3蛋白同时存在于胞质和胞核中,p-Smad3蛋白则主要表达在细胞核上。Western Blot结果显示,与TGF-β1刺激组比,阻断剂LY-364947和PA-B可抑制TβRI、TβRII、Smad2、Smad3、p-Smad3蛋白表达(P<0.05),同时促进Smad7表达(P<0.05),与免疫组化定量结果一致。结论1.美洲大蠊抗肝纤维化活性部位PA-B能显著抑制大鼠肝星状细胞的增殖、迁移,且可能是通过线粒体膜电位途径诱导其凋亡,从而起到抗肝纤维化的作用。2.美洲大蠊抗肝纤维化活性部位PA-B可抑制大鼠肝星状细胞合成分泌Col-I、Col-III和α-SMA蛋白,其机制可能与抑制TGF-β1/Smad信号通路有关。