镉胁迫对泥鳅的毒理效应及金属硫蛋白基因表达的影响

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泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)属鲤形目、鳅科、花鳅亚科、泥鳅属,因其肉质鲜美、市场需求旺盛,已经成为我国重要的水产养殖对象。目前,镉(Cd)已经成为水域环境主要的重金属污染物之一,严重影响了泥鳅的无公害生态养殖,同时也严重危害生态环境及人类健康。本研究对Cd2+胁迫对泥鳅抗氧化酶活性的影响及超微结构的损伤进行了研究;克隆并分析了泥鳅金属硫蛋白(MT)cDNA序列;对Cd2+胁迫下泥鳅MT基因的表达情况进行了研究。主要结果如下:1镉胁迫对泥鳅的毒理效应研究①以泥鳅为试验对象,采用体外暴露方法,研究了10d内不同浓度Cd2(+0mg/L、0.05mg/L、0.5mg/L、5mg/L)胁迫对泥鳅肝脏和鳃中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性的影响。结果表明:0.05mg/L浓度组和0.5mg/L浓度组Cd2+对泥鳅肝脏和鳃中SOD活性存在显著诱导作用,随着胁迫时间的延长,SOD活性存在一定程度的下降;5mg/L浓度组Cd2+对肝脏和鳃中SOD活性先诱导后抑制,随着胁迫时间的延长,活性受到显著抑制。0.05mg/L浓度组Cd2+对肝脏和鳃中CAT活性无显著影响,0.5mg/L浓度组和5mg/L浓度组Cd2+对肝脏和鳃中CAT活性先诱导后抑制,随着胁迫时间的延长,活性出现显著抑制。三种浓度Cd2+对肝脏和鳃中GSH-PX活性先诱导后抑制,最终均出现显著抑制。Cd2+浓度越高,胁迫时间越长,对泥鳅抗氧化酶活性抑制的时间越提前,抑制作用越显著。②通过透射电镜和扫描电镜技术观察了以上三种浓度Cd2+胁迫10d后泥鳅肝脏和鳃超微结构的变化。结果表明:0.05mg/L浓度组泥鳅肝脏细胞核内染色质增多,聚集于核膜四周;0.5mg/L浓度组肝脏线粒体肿胀,细胞核变形并偏离中心,内质网扩张;5mg/L浓度组细胞核收缩变形,染色质边集,线粒体肿胀扩张,内质网膨大变形,细胞出现凋亡。0.05mg/L浓度组泥鳅鳃丝、鳃小片表面出现分泌物,鳃小片前端出现破损;0.5mg/L浓度组鳃丝水肿隆起,鳃小片聚拢变形甚至缺损糜烂;5mg/L浓度组鳃组织病变,鳃小片坏死脱落,鳃丝严重破损。Cd2+浓度越高,泥鳅肝脏和鳃超微结构受损越严重,且损伤不可逆转。泥鳅肝脏和鳃超微结构的损伤可能与脂质过氧化有关。2泥鳅金属硫蛋白cDNA的克隆与分析采用PCR方法从泥鳅肝脏中获得了编码泥鳅金属硫蛋白(MT)的cDNA片段。该cDNA片段大小为434bp,其中包含可编码60个氨基酸残基的180bp的开放阅读框。预测泥鳅MT分子量为6035.9Da,等电点为8.05。序列比对显示该MT序列和其他鱼类MT序列高度保守,与细鳞泥鳅MT-ⅠA的同源性达到98%,同时具有脊椎动物MT中Cys的典型排列特征(Cys-X-Cys或Cys-Cys)。泥鳅主要组织MT基因表达存在显著差异,其中,脑的表达量约是其他组织的1.5-30倍,肠约是其他组织的12-20倍,其次为肌肉和鳃,而肝脏、眼睛和鳍中表达微弱,这可能与各组织的生理结构及功能不同有关。3镉胁迫对泥鳅金属硫蛋白基因表达的影响通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析了不同浓度Cd2+(0mg/L、0.25mg/L、2.5mg/L)胁迫24h、48h及72h对泥鳅肝脏和鳃中金属硫蛋白(MT)基因的相对表达水平的影响。结果表明:泥鳅肝脏和鳃MT基因的表达对外源Cd2+胁迫所表现出的反应存在差异,肝脏比鳃更为敏感。Cd2+浓度越高,胁迫时间越长,则肝脏和鳃中MT基因的相对表达水平越高。这可能与MT螯合Cd2+、参与免疫反应调控及为免疫酶类提供活性中心等原因有关。在受到Cd2+胁迫时,肝脏和鳃中大量表达MT,以此降低Cd2+对机体造成的损伤。
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