目的探索烟曲霉菌ALB1基因在真菌与角膜粘附中的作用,为阐明真菌与角膜相互作用的分子机制提供资料。方法分别利用烟曲霉菌野生型菌株(B5233)与基因突变株(△alb1)孢子粘附单层角膜上皮细胞及角膜的体外器官和体内动物模型,通过检测细胞和角膜上粘附孢子的数量,确定ALB1基因突变对烟曲霉菌角膜粘附力的影响。1.比较两种菌株在单层角膜上皮细胞的粘附量将生长良好的角膜上皮细胞(HCEC),接种于24孔板,每孔1×10~5个细胞,培养6-8小时细胞贴壁,后换无血清培养液过夜。加真菌孢子悬液,真菌孢子量与细胞量比例为10:1,37℃、饱和湿度5% CO2的培养箱中孵育60min,用生理盐水冲洗三次,孔中加荧光白染色30s,荧光显微镜照相。再加细胞裂解液裂解上皮细胞,样品按不同稀释度均匀涂布于沙氏培养基平板上,37℃培养24h,计数形成的菌落。实验重复3次。2.小鼠眼器官模型观察两种菌株粘附量的区别Balb/c小鼠5只,经处理后取出眼球,置于96孔板内。10只眼分为两组,两组孔中分别加入B5233与△alb1真菌孢子悬液(浓度1×10~9CFU/ml),置于37℃、5% CO2的培养箱中孵育30min。取出眼球,用生理盐水冲洗三次,每组3只眼球检测载菌量;另2只眼球中性甲醛固定,石蜡包埋,切片后糖原染色(PAS染色)观察孢子粘附情况。实验重复5次。3.体内实验比较两种菌粘附力的区别8-10周Balb/c小鼠10只,分为两组,每组5只。腹腔麻醉,用滤纸片擦拭角膜表面,再将约0.5cm长的输液管套在小鼠眼球上,缝线固定。管内加0.5%EDTA 20μl,作用1h。移液器吸去EDTA后,两组分别加入两种菌株的真菌孢子悬液(浓度1×10~9CFU/mL)10μl,作用1h,去除套管,颈椎脱臼处死小鼠,摘取眼球用生理盐水洗三次。每组3只眼球用于载菌量检测,计数形成的菌落;另2只眼球用中性甲醛固定,石蜡包埋,糖原染色(PAS染色)观察孢子粘附。实验重复2次。结果1.角膜上皮细胞粘附实验检测两种菌株粘附量的区别1.荧光显微镜图片可见B5233菌株的粘附密度明显高于△alb1菌株。2.真菌负荷检测,其中B5233菌株组粘附数量为151635±27330个/孔(CV=18.0%),△alb1菌株组粘附数量为63333±15756个/孔(CV=24.9%), B5233菌株粘附率大于△alb1菌株。且两组差异具有统计学意义(P<0.01)。2.眼器官模型检测两种菌株的角膜粘附量区别真菌负荷检测,两种菌株粘附量分别为1676±313个/器官、675±102个/器官。B5233菌株粘附率大于△alb1菌株,且两组差异具有统计学意义(P<0.01)。3.动物实验比较两种菌株的角膜粘附量经真菌负荷检测,其中B5233菌株组粘附数量为680±121个/角膜(CV=17.8%),△alb1菌株组粘附数量为314±45个/角膜(CV=14.3%)。B5233菌株粘附率大于△alb1菌株。且两组差异具有统计学意义(P<0.01)。结论ALB1基因的突变使真菌孢子对角膜上皮细胞和在体及体外角膜的粘附力下降。目的研究小鼠角膜抑制白色念珠菌生长的机制方法小鼠角膜匀浆液上清和灭活真菌孢子裂解液刺激的人角膜上皮细胞、人角膜基质细胞培养上清分别与白色念珠菌共培养,每6h测600nm光密度(OD)值一次,最后根据各点测得的OD值绘制真菌的生长曲线。角膜匀浆液与白色念珠菌共培养2h、4h、6h后用PI染色,激光共聚焦显微镜照相,观察死亡真菌(PI染色阳性)比例。结果:1.角膜匀浆液上清对白色念珠菌生长曲线的影响角膜匀浆液上清与白色念珠菌共培养的30小时,实验组在6h后每个时间点上的OD值均高于对照组。2.HCEC细胞培养上清对白色念珠菌生长曲线的影响HCEC细胞加灭活的菌液刺激后收集的细胞培养上清与白色念珠菌共培养。真菌生长曲线表明HCEC培养上清对真菌生长没有任何作用。3.HTK与U937细胞培养上清对白色念珠菌生长曲线的影响用灭活的真菌裂解液对HTK与U937细胞的共培养体系进行刺激,收集的培养上清分别与白色念珠菌共培养30小时,实验组真菌的生长曲线也表明对菌液生长没有任何作用。4.角膜匀浆液上清对白色念珠菌存活的影响角膜匀浆液与白色念珠菌共培养2h、4h、6h后用PI染色,三个时间点均未见有角膜裂解液有促进或抑制孢子死亡的作用,但在作用4h、6h时,可见角膜裂解液促进真菌孢子萌发出芽。结论角膜对真菌具有天然的防御能力,只有当这种天然防御被破坏时(如角膜上皮结构的完整性被破坏时),真菌才有可能在角膜上定植,真菌性角膜炎才有可能发生。