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一、IL-35单链真核载体的鉴定及其表达动力学检测目的:对IL-35单链融合基因进行鉴定并检测其体内外表达情况。方法:将扩增的pc DNA3.1-IL35质粒,酶切后进行凝胶电泳,并对质粒进行基因测序鉴定。将pc DNA3.1-IL35质粒转染至293T细胞中,体外检测其表达。通过高压尾静脉注射将质粒注入小鼠体内,检测其组织分布及体内动态表达情况。结果:凝胶电泳显示扩增出一条大小约1263bp的特异条带,DNA测序结果显示小鼠IL-35融合基因中EBI3、IL-12p35和linker的连接顺序、方向及系列完全正确。pc DNA3.1-IL35质粒在体外转染293T细胞后,经ELISA证实IL-35能有效表达。小鼠高压尾静脉注射pc DNA3.1-IL35质粒后,能够在肝脏、心脏、脾脏以及肾脏组织中检测到IL-35的持续高水平表达。结论:小鼠IL-35单链融合基因系列及连接正确,pc DNA3.1-IL35质粒能够在小鼠肝脏、脾脏、肾脏等脏器中持续高水平表达,为进一步探讨IL-35在急性肾损伤的作用奠定了基础。二、IL-35对内毒素血症急性肾损伤的保护作用及机制目的:研究IL-35在内毒素血症急性肾损伤中的作用及其机制。方法:建立小鼠内毒素血症急性肾损伤模型。C57BL/6小鼠分为2组:实验组给予高压尾静脉注射IL-35质粒(pc DNA3.1-IL35,100μg/2ml PBS);对照组高压尾静脉注射空质粒(pc DNA3.1,100μg/2ml PBS);各组小鼠以HGT注射后7天给予腹腔注射LPS 10mg/Kg建立急性肾损伤模型。于注射LPS后12h、24h、48h取小鼠血清进行肾功能检测;取肾脏组织进行病理学、细胞因子表达情况以及炎症信号通路检测;应用流式细胞仪检测各时间点小鼠脾脏Th1、Th2、Th17及Treg细胞的比例。结果:IL-35能够显著改善内毒素血症小鼠的生存情况,差异具有显著统计学意义(P<0.002);肾功能及肾脏病理提示IL-35对内毒素血症急性肾损伤具有保护作用,实验组小鼠在各时间点血清肌酐及尿素氮均低于对照组,其差别具有统计学意义(P<0.05);肾脏病理提示IL-35预处理能够明显减少炎症细胞浸润和肾小管空泡变性。实验组小鼠肾脏局部促炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达显著降低,两组间比较有统计学差异(P<0.05);但对抑炎细胞因子IL-10的表达无明显影响。与对照组相比,IL-35预处理能够抑制LPS急性肾损伤时肾脏组织NF-κB信号通路中P65和ikk的磷酸化和表达((P<0.05)。结论:IL-35预处理能够明显改善内毒素血症小鼠生存率和肾损伤程度,其机制主要是通过减少肾脏局部炎症细胞浸润,抑制NF-κB炎症信号通路的活化,抑制促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β的产生发挥作用。三、IL-35对缺血再灌注肾损伤的保护作用及机制目的:研究IL-35在缺血再灌注肾损伤中的作用及其机制。方法:双侧肾蒂夹闭法建立小鼠肾损伤模型。C57BL/6小鼠分为2组:实验组给予高压尾静脉注射IL-35质粒(pc DNA3.1-IL35,100μg/2ml PBS);对照组高压尾静脉注射空质粒(pc DNA3.1,100μg/2ml PBS);各组小鼠以质粒注射7天后,行双侧肾蒂夹闭30min建立肾损伤模型。于肾脏再灌注后24h、48h取小鼠血清进行肾功能检测;取肾脏组织进行病理学、细胞因子表达情况检测;应用流式细胞仪检测各时间点小鼠脾脏Th1、Th2、Th17及Treg细胞分泌细胞因子的差异。结果:IL-35能够显著改善IRI小鼠的生存情况,差异具有显著统计学意义(P<0.001);肾功能及肾脏病理提示IL-35对IRI肾损伤具有保护作用,实验组小鼠血清肌酐及尿素氮均低于对照组,其差别具有统计学意义(P<0.05);肾脏病理提示IL-35预处理能够明显减少肾小管上皮细胞的坏死,降低单核巨噬细胞的浸润,两组间比较存在统计学差异(P<0.05)。实验组小鼠肾脏局部促炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达显著降低,两组间比较有统计学差异(P<0.05)。与对照组相比,IL-35预处理能够减轻肾小管上皮细胞的凋亡((P<0.05)。IL-35能有效抑制脾脏中CD4+T细胞分泌IFN-γ和IL-17,两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:IL-35预处理能够明显改善IRI小鼠生存率和肾损伤程度,其机制主要是通过减少肾脏局部炎症细胞浸润,抑制促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β的产生,降低肾小管上皮细胞凋亡发挥作用。IL-35能有效抑制脾脏中CD4+T细胞分泌IFN-γ和IL-17,从而减少炎症细胞浸润。四、炎症因子在肾移植术后早期移植肾损伤中的作用研究目的:研究炎症细胞因子在临床肾移植患者术后早期移植肾损伤中的作用。方法:2015年9月至2017年3月于苏州大学附属第一医院泌尿外科接受肾移植的45例患者为研究对象,其中男性31例,女性14例,平均年龄37岁;依据患者术后肾功能恢复情况及是否需要血透治疗,将患者分为两组移植肾功能延迟恢复组(DGF组)和早期移植肾功能恢复良好组(IGF组)。分析两组患者的临床特征、DGF的危险因素及预后。留取肾移植术后早期患者血液、尿液标本,ELISA法检测IL-35含量,流式细胞CBA法检测炎症细胞因子含量(包括:IL-2、IL-4、IL-6、IL-1β、IL-17A、IL-10、IL-21、TNF-α、IL12p70、IFN-γ),分析与DGF的相关性。结果:所有患者肾移植手术均成功,其中13(28.9%)例术后发生移植肾功能延迟恢复(DGF组),32(71.1%)例术后早期肾功能恢复良好(IGF组)。两组患者在性别、年龄、BMI、透析方式及时间、免疫诱导及维持方案、HLA错配及冷缺血时间等基本临床特征方面均无差异。肾移植术后一月内,DGF组发生急性排斥的比例显著高于IGF组(23.1%VS 9.3%)。对DGF的危险因素分析发现,冷缺血时间超过12h、供体年龄大于45岁、供体末次血肌酐大于130μmol/L是DGF独立的危险因素;随访至术后一年,DGF患者术后短期及长期的肾小球滤过率均低于IGF组,两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。术后两周内,DGF组血清及尿液IL-35的含量显著低于IGF组(P<0.05),而尿液中促炎细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量显著高于IGF组(P<0.05)。结论:肾移植术后,动态监测血尿中促炎因子、抑炎因子的含量,能够早期预警移植肾损伤及其预后,有望成为术后早期急性移植肾损伤的监测指标。