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背景与目的随着经济发展和生活方式的改变,非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liverdisease,NAFLD)正逐渐成为全球发病率最高的慢性肝病之一。目前,我国成人NAFLD患病率约为15-20%。NAFLD成为继病毒性肝炎、酒精性肝病后,肝硬化和肝癌的主要病因,并通过加重糖、脂代谢紊乱,促进代谢性疾病的发生与发展。近年来,肝脏因子与NAFLD等代谢性疾病的关系备受关注。研究表明肝脏因子硒蛋白P(Selenoprotein P,SeP)在NAFLD、2型糖尿病及肥胖患者外周血中升高,且被认为能够促进胰岛素抵抗。然而SeP与NAFLD的关系及其背后的分子机制尚未阐明。因此,本研究拟从国人NAFLD患者中SeP血清学特征和SeP与肝脏脂肪变性的关系入手进行探究,以期为NAFLD的诊断提供新思路,并且进一步阐释NAFLD的发生发展机制。方法为了探究NAFLD患者中SeP血清学特征,我们进行了一项病例对照研究。对象来源于2016年3月至2016年10月期间于浙江大学医学院附属第一医院参加体检的人群。采用调查表询问一般情况及既往病史,并采集其体格检查数据。空腹抽血测定血清学指标,并采用人SeP酶联免疫吸附测定试剂盒测定血清SeP浓度。研究对象肝脏脂变的诊断主要通过腹部B超进行。为进一步探究SeP在NAFLD中的作用机制,体内实验我们选取雄性C57BL/6小鼠,采用高脂饮食喂养,诱导NAFLD动物模型;体外实验选用人肝癌细胞株HepG2细胞,采用400μM棕榈酸刺激24h诱导NAFLD细胞模型。利用荧光实时定量PCR及蛋白免疫印迹等手段检测NAFLD小鼠及细胞模型中SeP的mRNA、蛋白表达变化。体外采用小干扰RNA干扰技术抑制SeP表达,质粒转染技术提高SeP表达,并用SeP纯化重组蛋白培养细胞。利用细胞内甘油三酯含量测定观察SeP表达变化对肝细胞脂肪变性的影响,进一步采用蛋白免疫印迹等分子生物学手段分析SeP对相关信号通路的调控作用。结果病例对照研究共纳入158名研究对象,其中NAFLD患者79例,对照组79例,两组对象之间年龄和性别无显著差异。NAFLD患者血清SeP水平显著高于对照组(13.4±7.0vs.11.1±7.1μg/mL,p<0.05)。随血清 SeP 的升高,NAFLD 的检出率呈升高趋势,其中中等SeP组NAFLD检出率显著高于低SeP组(58%vs.38%,p<0.05)。而且随着NAFLD严重程度的增加血清SeP水平显著升高;其中,中度NAFLD组血清SeP浓度(13.1±5.7μ/mL)和重度组(15.6±8.1μg/mL)显著高于非NAFLD组SeP浓度(11.1±7.1 μg/mL),值分别小于0.05和0.01。进一步分析提示,血清SeP水平与NAFLD危险因素体重指数(r=0.287,p<0.05)、谷丙转氨酶(r=0.275,p<0.001)、谷草转氨酶(r=0.199,p<0.05)、谷氨酰转肽酶(r=0.231,p<0.01)及血清尿酸(r=0.208,p<0.01)呈正相关。SeP蛋白在NAFLD小鼠及细胞模型中表达均明显升高,而sepplmRNA在两模型中表达下降。体外小干扰RNA抑制SeP表达能显著降低肝细胞内甘油三酯含量,提高腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine Monophosphate Activated Protein,AMPK)及乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-Co A carboxylase,ACC)磷酸化水平;体外SeP过表达能显著加重肝细胞脂肪变性并降低AMPK及ACC磷酸化水平。采用SeP纯化重组蛋白培养HepG2细胞后,细胞内甘油三酯水平随SeP处理浓度的升高呈上升趋势。结论NAFLD患者中血清SeP水平升高,且SeP与NAFLD患病风险及疾病严重程度有关。血清SeP水平与NAFLD危险因素如体重指数、尿酸等呈正相关。在NAFLD模型中SeP蛋白水平上升,抑制SeP表达能改善肝细胞脂变而高表达SeP则加重肝细胞脂变,推测SeP可能通过AMPK-ACC信号通路对肝细胞脂质代谢进行调控,影响肝细胞脂肪贮积。本次对NAFLD中SeP血清学特征和作用机制的调研可以为未来NAFLD血清学诊断标志物的筛选提供思路,也为NAFLD的治疗提供新靶点。