目的：脓毒症（Sepsis）是由感染引起的全身炎症反应综合征（Systemicinflammatory response syndrome，SIRS），也是严重创伤、烧伤、休克、大手术后常见的并发症之一[1,2]，其发病机制复杂，目前尚无特效疗法，病死率极高。长期以来，人们不断探讨脓毒症的发病机制，以期寻找有效治疗措施，但是结果难以让人满意。神经-内分泌-免疫网络理论的出现为我们进一步认识脓毒症的发病机理提供了新的契机，在此网络研究中下丘脑-垂体-肾上腺轴(Hypothalamic-Pituitary-AdrenalAxis, HPAA)备受关注[4]。HPA轴作为神经-内分泌-免疫网络的枢纽，在机体遭受感染、创伤等应激反应后被激活，而HPA轴激活的起始点在下丘脑室旁核（PVN），PVN除参与神经内分泌的调节外，还参与自主神经系统的调节，并为神经免疫调节的整合中心。以往研究证明[5,30]，一氧化氮合酶（NOS）、促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、即刻早期基因（c-fos）共存于PVN，NOS催化产生的NO可能参与了c-fos、CRH的调节，进而启动HPA轴。亦有研究报道[6]，脓毒症早期HPA轴处于过度激活状态。通过研究HPA轴在脓毒症中的变化，将有助于阐明脓毒症的本质，并有望开辟脓毒症临床干预的新途径。乌司他丁是从健康成年男性新鲜尿液中分离纯化出来的一种糖蛋白，其能抑制多种蛋白酶活性，具有减少炎症介质释放，调节过度炎症反应，清除氧自由基，抑制心肌抑制因子产生,减轻组织损伤，促进机体康复等作用。本研究采用盲肠结扎穿孔(CLP)法制备大鼠脓毒症模型，通过观察脓毒症早期大鼠PVN内NOS表达的变化，探讨NO在脓毒症早期HPA轴激活中的作用及其机制，并观察乌司他丁对PVN内NOS表达的影响，进一步探讨乌司他丁对创伤、脓毒症早期大鼠HPA轴的调节作用。方法：大鼠脓毒症模型的制备采用经典的盲肠结扎穿孔(CLP)法，健康清洁级雄性Wistar大鼠40只，体重200～250g之间，按体重编号随机分为4组：(1)对照组(Control group)：不给予任何处理，直接处死；(2)假手术组(Sham group)：只开腹，拉出盲肠，翻动肠管，不结扎和穿孔盲肠，关腹；(3)盐水组（NS group）：CLP术后腹腔注射生理盐水（10ml/Kg）；(4)乌司他丁组（UTI group）：CLP术后腹腔注射乌司他丁10万U/Kg(药物浓度为1万U/ml)。除对照组外，各组均术前颈总动脉置管，观察血压和心率。各组术后均在股部皮下注射生理盐水30ml/kg，补充术中液体丢失量和生理需要量。各组均于术后6h麻醉后断头活杀，冰台操作，立体显微镜下分离出下丘脑室旁核，用锡纸包裹后放入液氮中保存。逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain raction，RT-PCR)半定量检测PVN内nNOSmRNA、iNOSmRNA、c-fosmRNA、CRHmRNA表达水平。Western blot检测PVN内nNOS、iNOS、c-fos、CRH蛋白表达水平。所得数据采用SPSS13.0版统计软件(SPSS Company，Chicago，Illinois，USA)进行统计分析，正态数据以均数±标准差(x±s)表示，方差齐时，各组均数的比较行单因素方差分析（ANOVA），方差不齐时采用非参数秩和检验，用最小显著性差异法行两两比较。P<0.05认为差异有统计学意义。结果:1大鼠术后一般情况观察：假手术组大鼠术后清醒较早，活动基本如常。盐水组大鼠术后苏醒延迟，精神萎靡，活动明显减少，眼角分泌物增多，竖毛，呼吸急促，动物处死剖腹可见血性渗出液，肠管胀气、水肿，部分盲肠末端发黑坏死，有恶臭。乌司他丁组大鼠脓毒症表现较盐水组大鼠表现轻。2CLP术后6h PVN内nNOSmRNA、iNOSmRNA、c-fosmRNA、CRHmRNA表达水平变化：盐水组iNOSmRNA表达水平高于假手术组和对照组iNOSmRNA表达（1.25±0.05VS0.85±0.05，1.25±0.05VS0.77±0.07，均P<0.05），乌司他丁组iNOSmRNA表达水平低于盐水组iNOSmRNA表达（0.57±0.04VS1.25±0.05，P<0.05），假手术组iNOSmRNA表达水平高于对照组iNOSmRNA表达（0.85±0.05VS0.77±0.07，P<0.05）（Fig.3； Fig.10；Table1）。盐水组nNOSmRNA表达水平低于假手术组和对照组nNOSmRNA表达（0.95±0.03VS1.04±0.02，0.95±0.03VS1.39±0.03，均P<0.05），乌司他丁组nNOSmRNA表达水平高于盐水组nNOSmRNA表达（1.44±0.03VS0.95±0.03，P<0.05），假手术组nNOSmRNA表达水平低于对照组nNOSmRNA表达（1.04±0.02VS1.39±0.03，P<0.05）（Fig.4； Fig.10；Table1）。盐水组c-fosmRNA表达水平高于假手术组和对照组c-fosmRNA表达（分别为1.08±0.08VS0.68±0.09，1.08±0.08VS0.31±0.1，均P<0.05），乌司他丁组c-fosmRNA表达水平低于盐水组c-fosmRNA表达（0.82±0.12VS1.08±0.08，P<0.05），假手术组c-fosmRNA表达水平高于对照组c-fosmRNA表达水平（0.68±0.09VS0.31±0.1，P<0.05）（Fig.5；Fig.9；Table1）。盐水组CRHmRNA表达水平高于假手术组和对照组CRHmRNA表达（分别为0.72±0.06VS0.39±0.06，0.72±0.06VS0.33±0.04，均P<0.05），乌司他丁组CRHmRNA表达水平低于盐水组CRHmRNA表达（0.48±0.05VS0.72±0.06，P<0.05），假手术组CRHmRNA表达水平与对照组相比无统计学意义（0.39±0.06VS0.33±0.04，P＞0.05）（Fig.6； Fig.9；Table1）。3CLP术后6h PVN内nNOS、iNOS、c-fos、CRH蛋白表达水平的变化：盐水组iNOS蛋白表达水平高于假手术组和对照组iNOS蛋白表达（分别为1.73±0.18VS1.28±0.06，1.73±0.18VS0.76±0.05，均P<0.05），乌司他丁组iNOS蛋白表达水平低于盐水组iNOS蛋白表达（0.91±0.06VS1.73±0.18，P<0.05），假手术组iNOS蛋白表达水平高于对照组iNOS蛋白表达（1.28±0.06VS0.76±0.05，P<0.05）（Fig.7；Table2）。盐水组nNOS蛋白表达水平低于对照组nNOS蛋白表达（0.46±0.05VS0.54±0.05，P<0.05），盐水组nNOS蛋白表达同假手术组比较无意义（0.46±0.05VS0.52±0.04，P＞0.05），乌司他丁组nNOS蛋白表达水平高于盐水组nNOS蛋白表达（0.66±0.05VS0.46±0.05，P<0.05），假手术组nNOS蛋白表达同对照组比较无差别（0.52±0.04VS0.54±0.05，P＞0.05）（Fig.7；Table2）。盐水组c-fos蛋白表达水平高于假手术组和对照组c-fos蛋白表达（分别为0.77±0.02VS0.64±0.05，0.77±0.02VS0.33±0.04，均P<0.05），乌司他丁组c-fos蛋白表达水平低于盐水组c-fos蛋白表达（0.71±0.04VS0.77±0.02，P<0.05），假手术组c-fos蛋白表达水平高于对照组c-fos蛋白表达（0.64±0.05VS0.33±0.04，P<0.05）（Fig.8；Table2）。盐水组CRH蛋白表达水平高于假手术组和对照组CRH蛋白表达（分别为1.41±0.10VS0.99±0.11，1.41±0.10VS0.84±0.11，均P<0.05），乌司他丁组CRH蛋白表达水平低于盐水组CRH蛋白表达（1.21±0.15VS1.41±0.10，P<0.05），假手术组CRH蛋白表达水平高于对照组CRH蛋白表达（0.99±0.11VS0.84±0.11，P<0.05）（Fig.8；Table2）。结论:1本实验采用CLP法可成功复制脓毒症大鼠动物模型。2脓毒症早期，大鼠PVN内iNOSmRNA、c-fosmRNA、CRHmRNA表达升高，nNOSmRNA表达降低，且蛋白与基因表达一致，表明PVN内NO可能具有双重作用：一方面iNOS产生的NO诱导c-fos产生，c-fos作为第三信使诱导CRH产生，从而启动HPA轴，并使HPA轴处于过度激活状态；另一方面，由于nNOS产生的NO对HPA轴具有抑制作用，创伤、脓毒症时nNOS表达降低，nNOS产生的NO对HPA轴的抑制作用减弱，使HPA轴处于过度激活状态。3乌司他丁可降低脓毒症大鼠下丘脑PVN内iNOS基因及蛋白表达，进而抑制c-fos及CRH表达，同时升高nNOS基因及蛋白表达，加强NO对HPA轴的抑制作用，表明乌司他丁能抑制脓毒症早期大鼠HPA轴的过度活化，明显改善脓毒症大鼠的表现及体征，首次揭示了乌司他丁在脓毒症治疗中的中枢性抗炎作用及可能机制。