阿魏蘑漆酶同工酶酶学性质研究

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漆酶(Laccase,EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,具有作用底物广泛、产物无污染等优点,在食品制造、纺织印染、生物传感器等领域均具有极佳的应用潜力。漆酶同工酶LACC2和LACC6是阿魏蘑漆酶的主要组成成分,在阿魏蘑(Pleurotus eryngii var.ferulae)与胶红酵母(Rhodotorulla mucilaginosa)共培养提高漆酶表达水平的过程中,LACC2和LACC6的基因转录水平分别发生明显的上和下调。本论文围绕LACC2和LACC6进一步展开酶学性质等方面的探究,为共培养促进漆酶生产的机理研究提供理论依据。主要研究结果如下:(1)将基因lacc2和lacc6分别与表达载体pPIC9K相连,转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115感受态细胞中,获得重组菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-lacc2和P.pastoris GS115/pPIC9K-lacc6。通过对漆酶基因信号肽序列的切除以及诱导条件的优化,得到具有高漆酶表达量的两株重组菌株,酶活分别达到351.75 U·L-1和8578.34 U·L-1。(2)利用镍柱纯化得到电泳纯漆酶蛋白LACC2和LACC6,并分析比较其酶学性质。研究结果显示,以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为底物时,LACC2和LACC6的最适反应pH均为3,最适反应温度均为50℃;低浓度的K+、Cu2+、Co2+和Mn2+均可在不同程度上提高LACC2和LACC6的酶活,但对LACC2的促进作用更为明显,Fe2+和Fe3+对LACC2和LACC6均表现出明显的抑制作用;与LACC6相比,LACC2对各类有机溶剂和表面活性剂的耐受力相对较强,但容易受到抑制剂的影响;动力学研究发现,LACC2和LACC6的最适底物均为ABTS,Km值分别为0.13mmol·L-1和0.24 mmol·L-1。与其他真菌、细菌及昆虫来源的漆酶相比,阿魏蘑来源的LACC2和LACC6对底物ABTS的催化效率相对更高。(3)分别在毕赤酵母和大肠杆菌中实现漆酶小亚基基因sspoxa3a和sspoxa3b的表达,其中在真核表达系统中所得的SSPOXA3a和SSPOXA3b分别与LACC2进行混合,可使LACC2的酶活比原来提高24.44%和29.94%,此外,LACC2的稳定性及pH耐受力也得到了提高。小亚基与LACC2结合可有效提高漆酶的酶活及稳定性,与前期研究中共培养后漆酶基因lacc2与sspoxa3a、sspoxa3b的转录水平得到一致提高的结果相符。
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