目的:人绒毛膜促性腺激素(hCG)是妊娠、妊娠相关疾病和各种癌症的重要标志物,hCG分子免疫检测技术的研究具有重要的医学价值。在生物信息学分析的基础上,应用RAD多肽展示体系制备抗hCG类抗体分子,测试改造后类抗体的抗原结合活性等,检验其应用潜力,为进一步优化hCG临床免疫检测技术提供实验支持。方法:利用生物信息学工具预测RAD嫁接类抗体蛋白的结构和性质。通过合成hCG结合多肽插入RAD多肽展示位点的类抗体基因,将其与sfGFP基因序列融合后,插入到带有His标签的原核表达载体pET30a(+)中,构建pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP原核表达质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),使用IPTG诱导表达蛋白,利用Ni-NTA亲和柱纯化蛋白,应用SDS-PAGE鉴定所得蛋白是否为目标蛋白。通过亲和吸附-GFP荧光检测方法测定类抗体蛋白对hCG的结合活性,并与应用单域抗体通用骨架制备的嫁接抗体和商业单克隆抗体进行比较,分析其结合特异性和生化稳定性水平。结果:通过生物信息学分析,RAD嫁接类抗体的分子量为58.93 kDa,理论等电点为6.23,属亲水性蛋白,具备较好的稳定性,不存在跨膜区域和信号肽序列。通过二级和三级结构建模,表明该蛋白具备良好的空间结构。利用原核表达实验成功制备了纯度较高的RAD嫁接类抗体蛋白,发现该蛋白在大肠杆菌中表达较好,高度可溶,且实现了高水平生产和快速纯化。生化实验表明,与其他骨架嫁接蛋白和经典途径制备的商业单克隆抗体相比,RAD嫁接类抗体具备优异的hCG抗原结合活性,对hCG的结合特异性相对较高,但与促黄体生成素(LH)存在一定的交叉活性。同时,RAD嫁接类抗体在不同温度和pH环境中显示出了较好的生化稳定性。结论:应用RAD多肽展示体系成功制备了抗hCG类抗体分子,具有良好的可行性;相较于商业单克隆抗体,RAD嫁接类抗体对hCG分子具有更好的抗原结合活性和特异性,且显著优于单域嫁接抗体,是一种具有应用潜力的抗体替代分子。