松材线虫Bursaphelenchus xylophilus,是一种严重危害我国和世界很多国家和地区的松林的极度危险的外来有害入侵生物。由其引发的松树萎蔫病(pine wilt disease)能够造成松树树势衰减和萎蔫,最终枯萎死亡,对我国和世界很多国家和地区的林木健康和生态平衡造成了严重影响。低温是松材线虫在自然条件下影响松材线虫生存发育和扩散传播的重要环境信号之一,是松材线虫持续向气候寒冷地区入侵和越冬过程生存时需要适应并克服的环境条件。同时,低温也是诱发松材线虫二龄幼虫向抗拟态三龄幼虫转变,进而促使松材线虫发育为抗拟态四龄幼虫后被松墨天牛携带并扩散的重要环境信号因子之一。但是,松材线虫低温响应的分子机理领域相关研究目前仍然很少。本研究验证了数个基因与松材线虫低温响应过程的密切关系。这些研究成果将为基于松材线虫响应低温分子机理,开发新的分子防治靶标提供理论基础。本论文以松材线虫为研究对象,通过低温和常温下的松材线虫存活率统计,发现了5℃恒定低温环境条件下的松材线虫具有显著升高的存活率。为了进一步研究松材线虫的低温响应分子机理,利用高通量转录组测序技术,得到了低温处理组和常温对照组松材线虫的转录组数据。通过差异表达基因分析,筛选出了松材线虫低温响应过程密切相关的数个代谢通路和基因家族。克隆鉴定了 6个松材线虫GPCR基因、3个cGMP信号通路基因和1个脂肪酸代谢相关的Bx-SCD基因。重点分析了松材线虫6个GPCR基因、3个cGMP信号通路基因、4个IIS信号通路基因和9个抗逆相关基因的低温响应模式。验证了 1个GPCR基因、3个cGMP信号通路基因和3个细胞色素P450家族基因在松材线虫低温响应过程中的关键功能。主要的研究结果如下:1、通过对松材线虫在低温条件下的存活率的统计,发现5℃非结冰恒定低温条件下的松材线虫相比于25℃常温组的松材线虫会表现出显著升高松材线虫的存活率,表明5℃恒定低温能够延长松材线虫的寿命,为后续的松材线虫低温响应分子机理研究提供了基础参考。2、通过低温处理和常温处理松材线虫的转录组测序和文库构建,共获得了312138316个高质量reads,并从中鉴定出432个显著差异表达基因。通过对差异表达基因的分析,发现了可能与松材线虫低温响应密切相关的数个代谢通路和几类重要的基因,涵盖调控环境信号感受、逆境适应、氨基酸糖类和脂肪等能量代谢相关的基因和通路以及一些调控次级代谢过程的基因等。这些结果为后续的低温响应过程中关键基因的鉴定和功能验证等研究提供了基本的数据支持和参考。3、通过转录组差异表达基因数据分析,筛选鉴定了 6个符合典型7次跨膜受体特征的松材线虫GPCR基因。荧光定量PCR结果表明这6个GPCR基因正向响应低温处理。通过设计特异性引物生产的dsRNA能够显著降低松材线虫BxGPCR17454的转录水平,BxGPCR17454基因沉默能够显著降低松材线虫在低温下的存活率。松材线虫的GPCR基因与低温响应过程密切相关,BxGPCR1 7454是调控松材线虫低温响应过程的关键基因之一。4、通过同源序列检索,克隆并鉴定了松材线虫cGMP信号通路的3个重要基因Bx-daf-11、Bx-tax-2 和 Bx-tax-4,其编码的 Bx-DAF-11、Bx-TAX-2 和 Bx-TAX-4 与其他线虫的同源蛋白表现出高度的同源性,序列特点与同源基因的典型特征相符。Bx-daf-11可能编码一种膜结合形式的鸟苷酸环化酶,能与细胞外配体结合并合成cGMP。Bx-tax-2和Bx-tax-4可能编码膜结合离子门控通道,具有环核苷酸结合域,可能受到cGMP的调控进而控制细胞内外的离子流动。荧光定量PCR试验结果显示,这3个cGMP信号通路基因正向响应低温处理,转录趋势一致。IIS信号途径的4个基因BxDaf-16、BxAge-1、BxAkt和BxSgk-1的转录水平有显著变化,但响应的时间和趋势并不相同,说明IIS信号通路很可能是参与松材线虫低温响应过程的重要通路之一。cGMP信号通路的3个基因Bx-daf-11、Bx-tax-2和Bx-tax-4的基因沉默试验结果表明,通过设计特异性扩增引物引物生产的Bx-daf-11、Bx-tax-2和Bx-tax-4的dsRNA处理松材线虫能够显著降低对应的基因的转录水平。Bx-daf-11、Bx-tax-2和Bx-tax-4基因沉默组的松材线虫在低温下的存活率显著下降,说明cGMP信号通路的这3个基因是调节松材线虫低温响应过程的关键基因。5、通过同源序列检索,克隆并鉴定了松材线虫硬脂酰辅酶A去饱和酶的基因Bx-SCD。其编码的Bx-SCD蛋白与其他线虫的同源蛋白表现出高度的同源性,序列与其它同源基因具有相同的典型特征,含保守的脂肪酸去饱和酶催化结构域,可能具有催化降低脂肪酸饱和度的功能,属于质膜-脂肪酸去饱和酶域超家族。荧光定量PCR结果表明,脂肪代谢相关的Bx-SCD,抗氧化相关基因BxPrx、Bxy-ctl-1、Bx-sod-1、Bx-sod-2和Bx-sod-4,细胞色素P450家族基因BxCYP33C9、BxCYP33C4和BxCYP33D3这9个抗拟相关的基因正向响应低温处理。由Bx-SCD调控的脂肪酸代谢过程,由BxPrx、Bxy-ctl-1、Bx-sod-1、Bx-sod-2和Bx-sod-4调控的抗氧化调节过程,以及由BxCYP33C9、BxCYP33C4和BxCYP33D、3细胞色素P450调控的相关代谢过程可能是松材线虫在低温下的重要的细胞保护机制之一。基因沉默试验结果表明,对BxPrx的基因沉默不能降低松材线虫的低温存活率。对BxCYP33C9、BxCYP33C4和BxCYP33D3进行基因沉默能够显著降低松材线虫在低温下的存活率,是调节松材线虫低温响应过程的关键基因之一,也进一步证明了这3个细胞色素P450基因作为松材线虫防治靶标的潜在价值。