论文部分内容阅读
谱系重编程在肝病治疗,特别是终末期肝病(End-stage liver disease,ESLD)治疗领域被深入研究。安全高效的基因载体是该技术成功应用的关键。当归多糖(Angelica sinensis polysaccharide,ASP)表面覆盖大量活性基团,易于被阳离子化修饰,是一种新型、安全、高效的基因载体,近年来被广泛应用于基因传递。本论文使用水提醇沉法制备ASP,选用聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)对ASP进行阳离子化修饰,利用阳离子化当归多糖(ASP-PEI)与质粒HNF1A之间的静电相互作用力,制得cASP-pHNF1A自组装纳米粒,并且进一步对该纳米粒介导的肝脏细胞重编程做了研究。实验结果显示,cASP-pHNF1A自组装纳米粒形态圆整,大小均一,细胞转染效率高。诱导的人源肝细胞(Induced human hepatocytes,ihHeps)能表达肝脏标志蛋白ALB,AAT,CK18,CK19和药物代谢酶CYP450,UGT,GST,摄取和排泄吲哚菁绿(Indocyanine Green,ICG),储存糖原,摄取低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein,LDL)。因此,阳离子化当归多糖作为一种天然的基因载体,能够高效地介导细胞重编程,功能化的ihHeps细胞为肝细胞移植及其他细胞治疗手段在ELSD中的应用提供了可能。第一章综述对肝病的研究进展做了简单的概述;对细胞疗法在肝病及肝功能衰竭治疗领域中的应用进行了阐述;分别讨论了病毒型和非病毒型两大类基因载体的优缺点,对两类基因载体在肝细胞谱系重编程中的研究进展做了总结;查阅大量文献资料,概括论述和展望了天然多糖作为新型非病毒基因载体在谱系重编程中的应用;提出了本论文的研究目的、研究意义以及主要研究内容,对本论文的设计思路做出系统的规划,为本论文实验任务的顺利开展提供理论指导和依据。第二章中药多糖的提取、分离、纯化及结构解析本章研究内容围绕当归多糖的提取展开。使用传统水提醇沉工艺获取当归粗多糖,使用三氯乙酸除蛋白法和D315大孔树脂柱层析法对其进行纯化,得到精制的ASP。使用硫酸-咔唑法测定ASP中糖醛酸的含量,高效液相凝胶色谱法测定ASP的分子量为3255Da,刚果红实验结果表明ASP具有三螺旋结构,ASP的单糖组成为甘露糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:半乳糖:阿拉伯糖:木糖=0.23:0.17:14.41:0.39:1.68:0.87。第三章中药多糖的阳离子化修饰及表征本章研究内容围绕当归多糖的阳离子化修饰展开。选用聚乙烯亚胺作为阳离子化修饰试剂,在三乙胺的催化下,PEI能够与ASP在交联剂N,N’-羰基二咪唑(CDI)的作用下发生交联,PEI结合在多糖分子骨架上,完成对当归多糖的阳离子化修饰。Zeta电位测定、伯氨基含量测定和元素分析测定结果显示ASP-PEI带正电荷,N元素、H元素和C元素的含量明显高于ASP,实验数据一致表明PEI分子成功连接至ASP分子表面。采用傅立叶红外变换色谱(FT-IR)和核磁共振(NMR)技术对ASP-PEI的结构做进一步解析,相较于ASP而言,ASP-PEI的特征吸收峰放生了轻微位移,并且出现了新的质子峰,分析结果符合多糖阳离子化修饰的结构改造。第四章cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备、表征及细胞转导效率研究本章研究内容围绕cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备、表征及细胞转导效率展开。ASP-PEI与质粒HNF1A发生共沉淀,形成自组装纳米粒。粒径和电位的测定以及透射电镜的结果显示cASP-pHNF1A自组装纳米粒表面带正电荷、粒径在20-50nm之间、大小均一、呈规则的圆球状,有利于细胞内吞作用,提高基因传递的效率。MTT实验结果显示,自组装纳米粒的细胞毒性明显低于商业化的标准转染试剂PEI和Lipfectamine2000,与Lipfectamine3000近乎相等,符合基因载体安全、低毒的条件。使用GFP报告基因和qRT-PCR技术分别对纳米粒的细胞转导效率做了定性和定量分析,结果显示ASP-PEI与质粒HNF1A的质量比为20:1时制得的纳米粒的细胞转导效率最高,因此将其应用于后续肝脏细胞重编程研究。第五章cASP-pHNF1A自组装纳米粒介导的体细胞重编程研究本章研究内容围绕cASP-pHNF1A自组装纳米粒介导的肝脏细胞重编程展开。构建cASP-pHNF1A自组装纳米粒,成功高效地将HFFs细胞重编程为成熟的功能性人源肝脏细胞ihHeps。免疫印迹技术和免疫荧光染色的检测结果显示,ihHeps能够表达肝脏特异性蛋白ALB、AAT、CK18和CK19。qRT-PCR结果显示ihHeps能够分泌药物Ⅰ相代谢酶CYP450和Ⅱ相代谢酶UGT、GST。吲哚菁绿(ICG)摄取和排泄实验、过碘酸-希夫氏碱染色反应(PAS)反应以及LDL摄取实验结果表明ihHeps具有肝脏代谢、摄取、排泄、糖原储存以及调节脂蛋白合成和分泌的作用。