耐辐射奇球菌是一种极端微生物，对高剂量电离辐射、紫外线与化学诱变剂等表现出惊人的抗性。它是迄今为止被发现的最具抗辐射生物之一，这种能力归因于它高效的DNA损伤修复机制，也使它成为研究DNA损伤修复的理想模式生物。虽然在最近几十年里科学家们试图破解这个谜团并取得了很多突破性进展，但是我们对这种修复机制依然知之甚少。　　在我们的前期研究中，PprⅠ蛋白被认为是DNA辐射损伤修复过程中必不可少的蛋白之一，对整个DNA修复网络起着全局调控的作用，并且协调DNA修复过程中的众多通路蛋白的表达。它包含锌指-蛋白酶结构域，HTH结构域与GAF类似结构域。前不久，我们已经初步研究了HTH结构域的功能，发现它的DNA结合能力是PprⅠ在耐辐射修复中必需的。但是，其他两个结构域的具体功能及如何行使功能却一无所知。在此基础上，本文主要研究了PprⅠ蛋白的锌指-蛋白酶功能，探讨了PprⅠ蛋白酶与其底物在DNA损伤修复过程中的应激响应通路。相关的结果如下:　　1.发现了PprⅠ蛋白酶的底物DdrO。在体外，利用AKTA纯化了高纯度的PprⅠ蛋白和DdrO蛋白。通过SDS-PAGE检测，PprⅠ蛋白可以酶切DdrO蛋白。另外，这一试验结果再进一步由酶切混合物的质谱分子量测定与酶切产物的C-端蛋白序列测定进行了论证。在体内，通过Western blotting检测了野生株R1与pprⅠ缺失株YR1在辐照后DdrO蛋白的变化情况，发现在野生株R1中在辐照后DdrO蛋白条带消失1小时，而pprⅠ缺失株YR1的却始终存在。说明在体内PprⅠ蛋白决定着DdrO蛋白在辐照前后的变化。　　2.PprⅠ蛋白酶活性的启动需要Mn(2+)。在PprⅠ蛋白经EDTA处理去除残留金属离子后，再用各种常见金属离子筛选，发现只有Mn(2+)能够激活PprⅠ蛋白酶活性。另外，PprⅠ蛋白中金属离子结合位点HEXXE的四个氨基酸残基((His-118，Asp-119，His-122，Asp-149)也分别被定点突变，发现即使有Mn(2+)存在，蛋白突变体也不再含有蛋白酶活性。　　3.确立了PprⅠ蛋白酶的酶切位点和酶切序列。结合质谱测定的分子量与C端蛋白测序数据，推算出PprⅠ蛋白酶的酶切位点在Leu-108和Arg-109两残基之间。在酶切位点附近构建了一系列DdrO蛋白的定点突变体，再检测它们对PprⅠ蛋白酶的酶切情况，确定了酶切序列并建立了一个酶切模型。　　4.在体内外，DdrO蛋白可以特异性地结合DDR基因启动子。在体外，利用EMSA试验，确定了DdrO蛋白与DDR基因启动子能结合，其中包括ddrO基因自身启动子。在体内，通过ChIP试验，兔抗DdrO抗体可以富集特异性的DDR基因启动子，比非特异性抗体高出四倍以上，说明了在体内DdrO蛋白特异性地结合DDR基因启动子。　　5.RDRM位点是DdrO蛋白结合DDR基因启动子所必需的。经PCR获得各个缺失RDRM位点的DRRR基因启动子，再利用EMSA试验，检测DdrO蛋白与它们的结合能力，发现缺失RDRM位点的启动子不能与DdrO蛋白结合。另外，探索了在recA基因启动子中DdrO蛋白的最小结合序列，表明DdrO蛋白的确结合在RDRM位点之上。　　6.DDR基因启动子与DdrO结合促进PprⅠ酶切效率。我们体外纯化回收了大量recA与ddrO等基因的启动子，先与DdrO蛋白发生结合，再加入同样量的PprⅠ蛋白酶切，发现在特异性双链DNA存在的情况下，体外PprⅠ的酶切效率会大幅度地提升。利用EMSA进一步检测到，当PprⅠ加入后，DNA与DdrO的结合情况，发现迁移的条带消失，表明与DNA的结合被破坏。　　7.基因ddrO点突变体R109E的表型试验分析。构建了ddrO基因点突变体R109E，对γ射线，UV与过氧化氢等均非常敏感。在体内，突变体R109E的DdrO蛋白条带在辐照后始终出现，并不会被切割，表现出与pprⅠ缺失株YR1一致的结果。　　8.在辐照处理后PprⅠ解除DdrO对DDR基因的转录抑制。利用qRT-PCR，研究了在辐照后不同恢复时间R1，YR1，R109E与CR109E的各个DDR基因的转录水平，直观地分析了ddrO基因与pprⅠ基因对DDR基因的转录及表达的影响。　　综上所述，PprⅠ蛋白酶与其底物DdrO蛋白对DNA的损伤应激响应是不可缺少的。在辐照修复过程中，两者微妙的相互关系介导了一条超强高效的DNA损伤应激响应通路。该通路不同于其他细菌，如大肠杆菌，由LexA-RecA介导的经典SOS修复系统。因此，这种PprⅠ介导的通路对耐辐射奇球菌超强的耐辐射能力具有重大的贡献，也更全面地阐释了DNA损伤应激响应模型。