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【研究目的】1.研究烧伤脓毒症患者严重感染时外周血中性粒细胞功能的变化,包括中性粒的细胞数量,趋化功能,以及凋亡的改变,初步揭示脓毒症患者在严重感染期中性粒细胞的表型变化。2.建立CLP脓毒症小鼠模型,体外LPS刺激小鼠骨髓中性粒细胞模型,对CLP小鼠模型骨髓中性粒细胞的趋化、凋亡及表型进行检测研究,LPS刺激骨髓中性粒细胞体外细胞模型,使用P38抑制剂刺激中性粒细胞,初步揭示P38 MAPK信号通路对中性粒细胞表型的调节作用,为中性粒细胞在脓毒症的发病机制中的作用提供一定的理论依据,为临床脓毒症的治疗提供新的思路。【研究方法】1.临床试验部分:收集5例临床烧伤脓毒症患者感染期血液样本,同期收集5例健康青年志愿者作为对照组,通过Ficoll密度梯度离心法分离然后提纯中性粒细胞,通过台盼蓝染色观察中性粒细胞活性;瑞氏染色观察细胞形态以及CD66b染色鉴定其纯度;通过琼脂糖凝胶趋化实验检测趋化距离,流式细胞仪检测中性粒细胞的凋亡比例,同时检测中性粒细胞表面分子PD-L1(CD274)改变,行相关性分析,并对上述数据统计分析。2.动物模型部分:取20只雄性C57/B6小鼠按随机原则分为假手术组(Sham组,n=10)、盲肠结扎穿孔组(CLP组,n=10),术后连续观察72 h,进行生存率分析。另取10只雄性C57/B6小鼠同样按随机原则分为假手术组(Sham组,n=5)、盲肠结扎穿孔组(CLP组,n=5),检测小鼠骨髓中性粒细胞PD-L1(CD274)表型;同时通过Percoll密度梯度离心法提取Sham组以及CLP组小鼠骨髓中性粒细胞,台盼蓝染色鉴定其活性;瑞氏染色及流式细胞仪Ly6G染色鉴定其纯度;小鼠骨髓中性粒细胞的趋化功能通过琼脂糖凝胶趋化实验进行检测;通过流式细胞仪检测小鼠骨髓中性粒细胞的凋亡比例。3.体外细胞实验部分:提纯C57/B6正常小鼠骨髓中性粒细胞,将其分为正常对照组、脂多糖(LPS)刺激组、P38抑制剂SB 203580组、P38抑制剂SB203580+脂多糖(LPS)组,刺激12h后,通过流式细胞仪检测每组的中性粒细胞PD-L1(CD274)表型改变情况【研究结果】1.Ficoll密度梯度离心法提纯的外周血中性粒细胞,瑞氏染色见细胞核呈分叶状或者马蹄形,胞质呈现淡红色,流式细胞仪检测CD66b检测纯度,台盼蓝检测其活性,纯度及活性均大于95%。2.琼脂糖凝胶趋化实验显示,烧伤脓毒症患者外周血中性粒细胞趋化的距离低于正常健康组,并且凋亡延迟,检测到烧伤脓毒症患者外周血中性粒细胞高表达PD-L1(CD274)。3.动物实验部分,CLP模型组的生存率明显低于Sham组,流式细胞仪检测CLP组骨髓中性粒细胞与Sham组比较,其表面的PD-L1(CD274)高表达;Percoll密度梯度离心法提取Sham组以及CLP组小鼠骨髓中性粒细胞纯度活性均大于95%;CLP组骨髓中性粒细胞琼脂糖凝胶趋化实验,趋化的距离低于Sham组;CLP组的凋亡延迟,凋亡比例低于Sham组。4.体外实验部分,在脂多糖(LPS)刺激小鼠骨髓中性粒细胞12 h后,PDL1(CD274)的阳性表达率显著高于正常组;然而,经过脂多糖(LPS)刺激,使用了P38 MAPK信号通路的抑制剂SB 20358,中性粒细胞表达PD-L1(CD274)分子的阳性率显著低于脂多糖组。【研究结论】1.烧伤脓毒症患者及CLP模型小鼠中性粒细胞趋化功能受到抑制,凋亡延迟,中性粒细胞表面分子PD-L1(CD274)高表达。2.中性粒细胞表面PD-L1(CD274)分子的表达受P38信号通路的调控,在脓毒症状态下,P38的抑制剂可降低中性粒细胞PD-L1(CD274)的表达。