1研究背景与目的在几乎所有可兴奋细胞均存在的小电导钙激活钾通道(small-conductance Ca²⁺-activated K⁺channels,SK,KCa₂)可以被细胞内的Ca²⁺激活。根据基因编码的不同,SK通道分为SK1、SK2和SK3三种亚型。它们均属于非电压依赖性的Ca²⁺激活钾通道,可被蜂毒明肽（apamin）特异性的阻断。在心肌细胞存在的是SK1和SK2,并且主要表达在心房肌细胞,其中SK2对apamin的敏感性最高。研究显示敲除SK2通道的小鼠出现心房细胞复极化延长,心房颤动和心房扑动等快速性心律失常的易感性增加。因此,了解SK通道的调控机制,可以为室上性快速性心律失常的治疗提供一些理论依据。Junctophilin（JPH,JP）蛋白家族是参与形成膜耦联复合体（junctional membrane complexes,JMCs）的主要结构蛋白,使细胞膜和肌质网保持一个固定的距离,为二者之间的离子通道起耦联作用,维持细胞内Ca²⁺的稳态,是骨骼肌和心肌细胞内发生正常兴奋收缩偶联的结构基础。JPH在结构上包括N-末端区、α螺旋样区和C-末端区,N-末端区有8个重复序列的MORN结构域,划分为2个区域:MORNⅠ（MORN motifsⅠ^Ⅵ）和MORNⅡ（MORN motifsⅦ^Ⅷ）,研究认为MORN区是JPH与细胞膜表面离子通道耦联的结构域。JPH具有JPH1、JPH2、JPH3和JPH4四种亚型,其中JPH1存在于骨骼肌中,JPH2主要存在于心肌中,JPH3和JPH4主要在大脑中分布。有研究显示敲除JPH3和JPH4基因可引起肌质网的Ca²⁺不能通过RyR2调控小脑蒲肯野细胞SK2通道的功能。本实验室前期在心肌细胞和转染的HEK293细胞中通过Co-ip和GST pull-down的方法证明SK2和JPH2有相互作用;检测到二者在心房和心室肌细胞的T管膜上,以及转染的HEK293细胞膜上均有共定位。这些结果提示在体内外SK2和JPH2之间有相互作用。并且用RNA干扰技术敲减成熟小鼠心肌细胞JPH2的表达不会降低细胞内SK2的表达,但膜片钳实验结果显示SK2通道的Ca²⁺-激活K⁺电流(calcium-activated potassium current,I_k,Ca)显著降低,细胞内钙瞬变的峰值也出现降低。因此,JPH2可能通过影响细胞内的Ca²⁺稳态来调控心肌细胞内SK2通道的电流。为了进一步验证JPH2对SK2通道的调节功能,本实验采用已成功制备的SK2质粒、SK2和JPH2共表达质粒、SK2和JPH2突变体的共表达质粒（JPH2 MORN结构域点突变S101R和Y141H）,通过脂质体瞬时转染的方法分别转染HEK293细胞,采用Western blotting的方法检测HEK293细胞中JPH2和SK2通道蛋白的表达,采用全细胞膜片钳的方法检测JPH2对SK2通道I_k,Ca的影响,以确定在体外JPH2对SK2通道功能的影响。2材料方法1)重组质粒扩增和提取:采用实验室已成功构建并使用的SK2全长质粒（pSK2-IRES-EGFP）、SK2和JPH2共表达质粒（pSK2-IRES-EGFP+JPH2）以及SK2与JPH2 MORN结构域101和141氨基酸位点突变的共表达质粒(pSK2-IRES-EGFP+JPH2^S101R+Y141H)。2)细胞转染:采用脂质体瞬时转染的方法将提取好的三组质粒分别转入培养的HEK293细胞,根据实验要求将细胞分为以下3组:A组:单独转染SK2质粒的HEK293细胞B组:转染SK2和JPH2共表达质粒（pSK2-IRES-EGFP+JPH2）的HEK293细胞C组:转染SK2和JPH2突变的共表达质粒(pSK2-IRES-EGFP+JPH2^S101R+Y141H)的HEK293细胞3)Western blotting:转染48h后提取三组细胞的总蛋白,用特异性抗体检测SK2通道和JPH2蛋白的表达。4)测定I_k,Ca电流:转染质粒48h后,采用全细胞膜片钳模式记录以上三组HEK293细胞的SK2通道apamin敏感的Ca²⁺-激活K⁺电流(calcium-activated potassium current,I_k,Ca)。5)统计学分析:所有数值用平均值±标准误（mean±S.M.E）表示。利用OriginPro 8.0软件分析通道电流,用统计软件SPSS 21.0进行实验数据统计分析和制作电流密度-电压曲线,各组间的显著性差异采用单因素方差分析,P<0.05表示差异有统计学意义。3结果1)荧光显微镜下观察到转染SK2质粒、SK2+JPH2质粒以及SK2+JPH2^S101R+Y141H突变质粒的HEK293均有绿色荧光蛋白表达。2)Western blotting结果显示,转染pSK2-IRES-EGFP质粒的HEK293细胞中有SK2的表达,未检测到JPH2的表达,而转染pSK2-IRES-EGFP+JPH2质粒与pSK2-IRES-EGFP+JPH2^S101R+Y141H突变质粒的HEK293细胞中既有SK2通道的表达,也有JPH2蛋白的表达,两组细胞中SK2和JPH2蛋白的表达均无显著性差异。3)用全细胞膜片钳记录到转染的HEK293细胞中SK2通道I_k,Ca电流,转染pSK2-IRES-EGFP质粒和pSK2-IRES-EGFP+JPH2^S101R+Y141H突变质粒的HEK293细胞膜上apamin敏感的I_k,Ca电流无显著差异,与前两组相比,转染pSK2-IRES-EGFP+JPH2质粒的HEK293细胞I_k,Ca显著增加。4结论转染的HEK293细胞中有SK2和JPH2的表达,在体外JPH2能够增加细胞膜表面apamin敏感的I_k,Ca电流。