免疫检查点作为免疫细胞对靶细胞清除过程中的抑制性节点,在调节免疫反应的强度和持续性上具有重要作用。肿瘤细胞通过劫持这种抑制途径获得了免疫抵抗,实现了肿瘤免疫逃逸。免疫检查点抑制剂通过阻断免疫检查点与肿瘤细胞上配体的相互作用来恢复免疫细胞对肿瘤的攻击性。获得性免疫检查点抑制剂作为恶性肿瘤免疫治疗的重要手段,其在非小细胞肺癌治疗上显示的生存优势推动了科研工作者对多种免疫检查点抑制剂的探索。CD47作为先天性免疫检查点的代表,以往对它的研究主要集中在表达量及抑制剂的抗肿瘤作用上,而对其空间结构、分布以及聚集情况等结构性特征了解较少。同时,细胞膜上蛋白质的异常化组装与疾病的发生发展具有紧密联系。因此,为了了解CD47跨膜蛋白在肿瘤免疫逃逸中结构变化与功能异常之间的关系,我们采用最为便捷有效的直接观察法进行研究。然而,蛋白质的尺寸低于普通光镜分辨率的衍射极限,其详细的结构特征不能被清楚地显示出来。随着打破光学衍射极限的超分辨率荧光显微镜的问世,细胞膜蛋白的空间结构、分布模式以及分子间的相互作用等领域取得了巨大进展。其中,以分辨率高、操作便利、搭建条件相对容易的直接随机光学重构显微镜（direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy,d STORM）应用最为广泛。本论文即利用了d STORM成像技术对非小细胞肺癌细胞膜上的CD47进行了研究,研究成果如下:1.CD47在正常细胞与非小细胞肺癌细胞膜表面均呈异质性分布,有的点状零星分布,有的聚集成团。癌细胞相较于正常细胞而言,其上形成更多的CD47蛋白簇,平均簇面积更大也更为聚集,但各癌细胞间的CD47蛋白表达和分布无明显差异。原代细胞的实验结果也证实了CD47在癌细胞上的表达量高于正常细胞,同时形成了更大、更多的蛋白簇。这一工作证明,CD47在正常细胞上通常以小且稀疏的蛋白簇形式维持免疫稳态,而在癌细胞上则通过增大蛋白的聚集程度来更快的响应外部信号,为免疫逃逸提供结构基础。2.细胞膜上的功能单元结构连接紧密,功能彼此关联,为确定CD47聚集和分布机制,我们对CD47相关蛋白和功能区域进行了干预,并用d STORM超分辨显微镜观察CD47的变化情况。通过双色d STORM成像显示CD47与脂筏存在共定位关系,通过胆固醇抽提和恢复实验确定了脂筏结构的稳定有助于CD47聚集形成更大的蛋白簇。同时,使用细胞松弛素-B（Cytochalasin B,CB）和糖苷酶（N-acetyl-β-D-gulcosaminides,NAG）处理后,CD47的聚集程度显著下降,证明了细胞骨架和N-糖基化是CD47发生聚集不可或缺的条件。并且,通过双色d STORM成像确定了CD47与整合素αvβ3存在一定程度的共定位,而整合素αvβ3的基因沉默显著削弱了CD47的聚集,这表明整合素也是促使CD47聚集成簇的关键因素。3.肿瘤细胞上CD47的表达受到多种因素调控,TNF-NFκB信号通路作为介导炎症与肿瘤关系的关键桥梁,对CD47的聚集程度和分布模式也有着重要影响。通过在肺腺癌细胞系A549中加入TNF-NFκB炎性通路的刺激物与抑制剂观察CD47表达和分布的变化,我们发现,当信号通路激活时,促进CD47的表达并使CD47蛋白聚集成更大的团簇;当信号通路受抑制时,CD47的表达和聚集程度均呈下降趋势,并且这种抑制作用对化疗耐受细胞也有效。同时,我们也观察到了该信号通路对整合素αvβ3也存在类似的调控作用,并且影响着CD47和整合素αvβ3的共定位程度。这提示我们,TNF-NFκB炎性通路不仅对CD47蛋白成簇本身具有重要意义,还通过影响整合素αvβ3的表达和分布对CD47复合物产生显著的调控作用。