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我国是乳制品和肉类的消费大国,其中涉及的食品微生物安全问题不容忽视。小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)和大肠埃希氏菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是乳制品和肉类中的重要致病菌,容易引发食源性疾病,一直备受关注。传统的培养检测方法检测周期长且操作繁琐。以PCR为代表的分子生物技术虽缩短了检测周期,但难以用于市场抽查等现场检测。重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)作为新型恒温核酸扩增技术,对设备要求不高,可在常温下实现特定核酸序列扩增,扩增可通过琼脂糖凝胶电泳、结合探针等方法,5-20 min即可观察结果,能实现检测结果的快速可视化。本研究采用实时荧光RPA(real-time RPA)技术检测乳制品和肉类中的小肠结肠炎耶尔森氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7。根据致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌黏附侵袭位点ail(NC＿008800.1)致病基因和大肠埃希氏菌O157:H7的rfb E基因(S83460.1),分别进行了特异性引物和探针的设计与筛选,通过三种DNA提取方式的比较、不同RPA反应程序的优化、特异性、灵敏度、稳定性以及人工污染实验,建立了乳制品和肉类中这两种致病菌的实时荧光RPA(real-time RPA)检测方法,并在实际样品测试中得到了验证。研究结果表明:(1)在Magtration ~R 12GC PLUS核酸提取仪及其相应Mag DEA~R DNA200(GC)试剂盒、Kurabo Quick Gene DNA提取试剂盒和天根细菌基因组DNA提取试剂盒三种试剂盒中,天根试剂盒对样品溶液中的DNA提取效果最好。此外,水煮法在real-time RPA中也有一定可行性。(2)本研究建立的real-time RPA方法在37°C恒温下20 min内即可完成检测,特异性高,对致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7的目的DNA的检测限分别为0.1 ng/μL和0.01 ng/μL。(3)在稳定性实验中,选择从100 ng/μL～0.001 ng/μL系列浓度梯度的目的DNA进行平行测试。在检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌中,当DNA为0.1 ng/μL时,8个平行的阈值时间和最大荧光值的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)最低且≤7.06%。在大肠埃希氏菌O157:H7中,0.01 ng/μL及以上浓度DNA均可稳定检出。(4)致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌在奶粉和牛肉的人工污染样品中初始污染量为3CFU/25g时,培养20 h后,即可通过real-time RPA方法检出;大肠埃希氏菌O157:H7在牛奶和鸡肉中的初始污染量为4 CFU/25g时,培养9 h后即可检出。(5)采用本方法分别对20份乳制品和肉类实际样品检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7,与现有国家标准方法相比,本研究建立的real-time RPA方法与国家标准方法结果一致。综上,本研究建立的乳制品和肉类中的小肠结肠炎耶尔森氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7实时荧光RPA技术检测特异性强,常温检测灵敏度高,与国家标准方法检测结果一致,可大幅度缩短检测时间,可作为乳制品和肉类中小肠结肠炎耶尔森氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7的快速初筛和现场检测方法,对乳制品和肉类中的致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7的常温快速定性检测具有实用意义。