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目的:目前已知脂氧素A4(LXA4)可缓解脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS),但是,LXA4究竟是通过介导哪个候选基因促进肺上皮细胞钠离子通道(ENaC)开放而发挥其作用的详细机制尚不够明确。本研究主要探索LXA4究竟是通过介导哪个候选基因来调控ENaC的亚基表达?以及LXA4究竟是通过何种信号通路实现其对ENaC进行调控的?方法:1.建立ALI肺上皮细胞模型。将LPS应用于A549细胞(腺癌人类肺泡基底上皮细胞)培养液中建立ALI肺上皮细胞模型,并通过q RT-PCR(实时荧光定量PCR)测定并记录A549细胞ENaC亚基转录水平的变化。2.观察LXA4对A549细胞ENaC亚基转录水平的影响。将LXA4应用于A549细胞培养液中,通过q RT-PCR测定并观察ENaC亚基转录水平的变化。3.观察LXA4对已建立的ALI肺上皮细胞模型的ENaC亚基转录水平的影响。将LXA4添加到已含有LPS的A549细胞培养液中,通过q RT-PCR测定并观察A549细胞ENaC亚基转录水平的变化。4.对处理后的A549细胞进行转录组测序分析。通过对A549细胞组之间m RNA表达谱的比较,探寻LXA4发挥其治疗ALI作用所介导的潜在候选基因。5.通过q RT-PCR测定并观察其潜在候选基因m RNA的动态变化,以此寻找出可能的候选基因。6.采用q RT-PCR测定并观察经过LPS、LXA4、LXA4+LPS处理后的A549细胞组候选基因转录水平的变化情况。7.将不同浓度的LXA4应用于经LPS处理过的A549细胞培养液中,通过q RT-PCR测定并观察候选基因m RNA水平与LXA4浓度之间的关系,并通过western blot(蛋白质印迹法)测定并分析候选基因蛋白水平和LXA4浓度之间的关系。8.通过western blot测定和观察LXA4在不同时间间隔(0、1、2、4、6、8h)所处理的A549细胞候选基因蛋白水平与LXA4不同时间间隔处理之间的变化趋势。9.将LXA4受体(ALX)抑制剂(BOC-2)添加到LPS+LXA4处理过的A549细胞培养液中,通过western blot测定和分析候选基因和ENaC蛋白水平与BOC-2之间的关系。10.应用候选基因的si RNA对A549细胞进行处理,然后通过CCK-8(细胞计数试剂盒-8)测定并观察候选基因对A549细胞存活率的影响,并通过western blot测定并分析其对ENaC亚基表达水平的影响。11.通过利用PI3K(磷酸酰肌醇-3-激酶)抑制剂(LY294002)来明确PI3K信号通路是否参与了调控LXA4诱导候选基因的表达。结果:我们的实验结果显示:1.LPS抑制A549细胞ENaC亚基m RNA的表达,而LXA4则可增强A549细胞ENaC亚基m RNA表达,并且LXA4还可拮抗LPS对A549细胞ENaC亚基m RNA表达的抑制作用,此表明LXA4可有效缓解LPS所致的ALI。2.通过对处理后的A549细胞进行转录组测序分析后发现,潜在候选基因为PLIN2、ANGPTL4、LRP1及NDRG1等,而可能性较大的候选基因则为NDRG1。3.LPS可抑制NDRG1 m RNA的表达,而LXA4则可拮抗LPS的这种抑制作用,并可增强NDRG1 m RNA的表达。4.NDRG1m RNA表达水平随LXA4浓度的增加而升高,且NDRG1的蛋白表达水平与LXA4的浓度呈正相关;此外,LXA4还可以时间依赖性方式诱导NDRG1的蛋白表达。5.BOC-2可抑制LXA4诱导的NDRG1和ENaC的蛋白表达。6.NDRG1 si RNA不仅可抑制ENaC亚基的表达,而且还可降低A549细胞的存活率。7.LY294002不仅抑制NDRG1和ENaC亚基的表达,而且还抑制了SGK1磷酸化水平,从而揭示了LXA4介导候选基因NDRG1表达的信号通路为PI3K信号通路。结论:LXA4经由PI3K信号通路介导NDRG1的表达,增强A549细胞ENaC的表达水平,促进肺上皮细胞钠离子通道(ENaC)的开放,进而促进肺上皮细胞内的水分子排除,减轻肺水肿。本研究结果将为临床上治疗ALI/ARDS等呼吸急重症患者提供帮助,并为研究及开发治疗此类疾病的新药提供一定的理论支持。