论文部分内容阅读
目的世界大多数国家已经进入老龄化社会,而神经系统是衰老发生较早,且受损较为严重的系统之一。研究发现,调控神经干细胞(NSCs)衰老能明确延缓大脑衰老,但其机制尚不清楚。最新研究报道,无论是生理上的还是病理上的脑衰老过程都伴随着大脑神经元自噬流的减弱,可见细胞自噬与大脑衰老密切相关。人参是中国传统中医学里的“补气要药”,而人参皂苷则是人参中主要药物有效活性成分。研究小组前期已经证实,人参皂苷Rg1是人参中重要的抗衰老的单体成分。它可以通过抗氧化和拮抗炎症因子的产生来调节NSCs衰老,因此来延缓脑衰老。然而,人参皂苷Rg1是否通过调控NSCs自噬流活性以延缓脑衰老还未见研究报道。本研究目的在于探讨人参皂苷Rg1调节NSCs自噬活性拮抗致衰剂导致脑衰老的作用机制。方法1.C57BL/6J小鼠衰老模型建立:2月龄C57BL/6J小鼠购买于广州赛业生物科技有限公司(小鼠合格证书:SYXK粤2008-0090)。小鼠在重庆医科大学实验动物中心由专业工作人员饲养,环境适应1周后,60只小鼠随机分4组。D-gal组(衰老模型组),皮下注射D-gal(200mg/kg,qd×42)。D-gal+Rg1组(Rg1体内干预衰老模型组),在复制体内脑衰老过程中,从16d起腹腔注射Rg1(40 mg/kg,qd×27)。正常对照组(体内正常组),小鼠皮下注射等量生理盐水(qd×42)。Rg1正常组(Rg1体内干预组),小鼠皮下注射等量生理盐水16d,16d后腹腔注射Rg1(剂量同Rg1体内干预衰老模型组)。动物模型构建完成后第2d进行相关指标检测。(1)每日注射药物后监测各组小鼠饮食、体重、活动和精神状态等衰老体征变化。(2)检测小鼠认知和空间记忆学习能力(Morris水迷宫)。2.从新生小鼠脑组织中分离提取与纯化培养NSCs,培养至P3代时加药物干预,检测相应指标。(1)NSCs分离提取:取出生1d的新生小鼠全脑,切碎脑组织,胰蛋白酶消化5min,离心细胞悬液去除上清,加入NSCs完全培养基,NSCs悬浮生长2d,收集神经球,胰蛋白酶消化成单个NSC。此过程需要不断重复数10次,使NSCs可以逐步自然纯化,培养细胞至P3代,可以进行实验。(2)调整NSCs的数量1×10~5/ml,将其植入培养瓶中,NSCs分为4组。D-gal组(体外衰老模型组),加入D-gal(10mg/ml)共培养48 h;D-gal+Rg1组(Rg体外干预衰老模型组),加入D-gal(同D-gal组)共培养24h,再加入Rg1(20μg/ml),继续培养24h;体外正常组,常规培养48h;Rg1体外干预正常组,常规培养24 h,然后加入Rg1(剂量同上),继续培养24h。NSCs体外衰老模型建立后第2d,进行实验安排相应指标检测。(3)Nestin蛋白进行免疫荧光检测,鉴定各组NSCs和神经球(4)SA-β-gal细胞衰老染色检测NSCs衰老情况(5)流式细胞术检测NSCs的细胞周期(6)EDU检测NSCs增殖情况(7)透射电镜观察NSCs自噬体形态和数量变化(8)免疫荧光和Western-blot检测NSCs自噬相关蛋白LC3和P62(9)双荧光腺病毒转染NSCs后,激光共聚焦显微镜检测NSCs内自噬小体和自噬溶酶体的数量和超微结构。结果1、D-gal组小鼠逐渐出现神经退行性表现,如倦怠、精神萎靡、反应迟钝、嗜睡等。并且也出现毛色暗淡,饮食和饮水量都有所减少,免疫力下降等衰老现象。正常对照组、Rg1正常组和Rg1体内干预衰老模型组小鼠衰老体征表现不明显。2、Morris水迷宫行为学检测结果:D-gal组小鼠认知与学习记忆能力显著下降,注射Rg1干预后小鼠神经功能学指标明显改善。3、各组NSCs生长情况:体外培养加入致衰剂D-gal后,使NSCs生长形成的神经球大小不规则,而且总数量减少,体外培养加入Rg1干预后,神经球大小一致,密度均匀,神经球总数量明显增加。4、Nestin蛋白免疫荧光检测结果:在Rg1干预后(D-gal+Rg1组)NSCs的Nestin蛋白的表达增加,且阳性细胞的数量也增加。神经球鉴定显示其Nestin蛋白强度没有明显改变。5、SA-β-gal细胞衰老染色检测结果:培养体系中加入致衰剂D-gal后,使NSCs形成的神经球中衰老细胞的百分率显著增加,体外培养加入Rg1干预之后,SA-β-gal衰老染色阳性神经球的百分率明显下降。6、流式细胞术检测NSCs的细胞周期结果:体外培养加入致衰剂D-gal之后,D-gal组NSCs的周期中S期和G2期的百分率下降,G0-G1期百分率上升。加入Rg1干预后,D-gal+Rg1组NSCs的周期中S期和G2期百分率上升,G0-G1期百分率降低。7、EDU检测各组NSCs增殖结果:体外培养加入致衰剂D-gal,使NSCs的增殖能力下降,加入Rg1干预后,D-gal+Rg1组NSCs的增殖能力增强。8、透射电镜观察自噬小体超微结构与数量的结果:D-gal+Rg1和D-gal组NSCs中自噬小体数量比正常组明显增多,加入Rg1干预后,D-gal+Rg1组NSCs中可见较多单层膜结构的自噬溶酶体,也可见双层膜结构的自噬小体,提示Rg1干预后衰老NSCs多处于自噬的晚期。9、NSCs自噬相关蛋白表达结果:免疫荧光半定量分析和Western-blot试验结果都表明,与D-gal组相比,加入Rg1干预后,NSCs中LC3-II蛋白表达增加,P62蛋白表达明显减少。10、激光共聚焦显微镜结果显示,体外加入Rg1干预后,NSCs中的自噬体与自噬溶酶体数量都增加,表明人参皂苷Rg1促进自噬体降解,自噬流增强。结论1.D-gal可成功复制小鼠脑衰老模型,行为学表现与自然衰老小鼠一致,也可复制NSCs体外衰老模型。2.人参皂苷Rg1不仅能拮抗D-gal诱导的小鼠脑衰老,而且能拮抗D-gal在体外诱导NSCs的衰老。3.神经系统衰老与退行性病变都可能伴随NSCs自噬异常,脑衰老与NSCs衰老与自噬密切相关。4.Rg1通过增强自噬能拮抗D-gal所致的NSCs衰老,其机制可能与Rg1能促进细胞增殖、增加自噬小体数量、调控自噬相关蛋白表达、促进自噬流有密切关系。