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【目的】脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种严重的神经系统创伤疾病,具有高致死率、高致残率的特点。脊髓损伤的病理过程可分为原发损伤和继发损伤,其中继发损伤分急性期,亚急性期和慢性期三个阶段,而亚急性期可能在继发性损伤过程中起重要作用。蛋白质表达水平的变化在许多中枢神经系统疾病中起着关键作用。然而,亚急性期蛋白质组学信息的缺失制约了对该阶段病理机制的了解及干预。本课题采用同位素标记的绝对和相对定量(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation,iTRAQ)技术检测大鼠脊髓损伤前后脊髓组织蛋白的表达水平,对差异表达蛋白进行功能注释,并重点对脊髓损伤亚急性期差异蛋白进行生物信息学分析,寻找干预脊髓损伤亚急性期的潜在靶点,为修复脊髓损伤提供分子病理依据。【方法】1.实验分组:72只200 g-230 g Wistar成年雌性大鼠随机分成8组(每组9只,每3只作为一次生物学重复):A组,对照组;B组,SCI后0小时组;C组,SCI后4小时组;D组,SCI后8小时组;E组,SCI后1天组;F组,SCI后3天组;G组,SCI后1周组;H组,SCI后2周组。2.动物模型制作及取材:利用New York University(NYU)Impactor Model II型打击装置建立胸10节段脊髓挫伤模型,打击重量为10 g,高度为25 mm。对照组仅做相应节段的椎板切除。对实验组及对照组分别在脊髓损伤后0小时、4小时、8小时、1天、3天、1周、2周行心脏灌注,取出损伤区域1 cm组织。3.蛋白质组学分析:应用裂解液提取法提取出各组脊髓组织蛋白,2D Quant试剂盒测定每组蛋白浓度,应用Mascot软件对二级质谱图信息进行定性定量计算,采用iTRAQ/TMT质谱定量方法鉴定脊髓损伤组与对照组间的差异蛋白,对差异蛋白分别进行GO功能富集分析,KEGG信号通路富集分析,以及STRING蛋白互作网络分析,并筛选出其中处于核心位置的10个蛋白,作为SCI亚急性期的关键蛋白。【结果】1.脊髓损伤后蛋白质组学的时序变化:大鼠各SCI组与对照组比较,SCI后0小时,差异表达蛋白数为68个,其中,上调51个,下调17个;SCI后4小时,差异表达蛋白数为76个,其中,上调72个,下调4个;SCI后8小时,差异表达蛋白数为88个,其中,上调84个,下调4个;SCI后1天,差异表达蛋白数为64个,其中,上调61个,下调3个;SCI后3天,差异表达蛋白数为176个,其中,上调114个,下调62个;SCI后1周,差异表达蛋白数为295个,其中,上调204个,下调91个;SCI后2周,共鉴定差异表达蛋白162个,其中上调蛋白101个,占差异表达蛋白的62.35%,下调蛋白61个,占差异表达蛋白的37.65%。2.脊髓损伤亚急性期差异蛋白的生物信息学分析:本实验重点对脊髓损伤后2周差异表达蛋白进行生物信息学分析。GO功能富集分析发现关键分子功能、细胞组分、生物进程主要富集在转运体活性、单价无机阳离子转运体活性、溶酶体、神经递质转运以及对类固醇激素的反应等生物学过程与细胞组分;KEGG通路富集分析发现差异表达蛋白主要富集在溶酶体通路、粘多糖降解通路、吞噬体通路、cGMP-PKG信号通路以及甲状腺激素合成通路等信号通路;STRING蛋白网络互作分析发现血清白蛋白(Serum Albumin,Alb)、钙调蛋白1(Calmodulin,Calm1)、波形蛋白(Vimentin,Vim)、载脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)、突触结合蛋白(Synaptophysin,Syp)、蛋白质二硫化物异构酶(Protein Disulfide-isomerase,P4hb)、CD68、真核翻译延伸因子1α2(Eukaryotic Translation Elongation Factor 1-alpha 2,Eef1a2)、Ras相关蛋白Rab-3a(Ras-related protein Rab-3A,Rab3a)和半乳凝素3(Galectin 3,Lgals3)是其中核心差异表达蛋白。【结论】1.本研究成功绘制脊髓损伤亚急性期的差异蛋白表达谱。发现了Alb、Calm1、Vim、ApoE、Syp、P4hb、CD68、Eef1a2、Rab3a和Lgals3等与脊髓损伤修复相关的差异蛋白。2.脊髓损伤亚急性期差异表达蛋白主要富集在溶酶体通路、粘多糖降解通路、吞噬体通路、cGMP-PKG信号通路以及甲状腺激素合成通路等信号通路,是脊髓损伤亚急性期病理过程中的关键信号通路。3.探讨脊髓损伤亚急性期微环境中差异表达蛋白的作用机制,为修复脊髓损伤提供了分子病理依据。