论文部分内容阅读
衰老是人体生理功能逐渐消退的一个生物学过程,机体在衰老过程中伴随着因退行性变化导致的多种疾病,如心血管疾病、肿瘤等。随着人类生活水平的升高,追求健康长寿的生活越来越成为人们关心的问题。近些年来,全球环境日趋恶劣,环境中持续形成的自由基（环境毒性因子）不断的刺激人体,特别是老年群体的健康,进而对其寿命造成了不良的影响。因此,环境毒性因子（如过氧化物等氧化损伤因素）及遗传因素的持续影响,更促进了机体的衰老及其他衰老相关疾病的发生。人类早老性疾病（progeroid disease）是衰老研究的重要模型。Werner早老综合征（Werner Syndrome,WS）是由RecQ解旋酶家族Wrn基因突变引起人类常染色体隐性遗传病。由于小鼠细胞的端粒长度较长,因此在建立Wrn综合征的小鼠模型时,需要同时敲除Wrn和端粒酶,并繁殖小鼠到第五代（G5DM）,才能表现出人类Wrn综合征的早衰表型。这种G5代Wrn综合征小鼠的胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts,MEFs）在体外培养中迅速衰老,持续培养可导致部分细胞逃逸衰老。前期我们在研究G5DM细胞逃逸衰老时,发现了抑癌基因p53蛋白发生了p53N236S（简称p53S）突变,p53S是细胞逃逸衰老,并重新启动端粒维持机制的关键。通过比较研究G1-G5TM（Terc、Wrn、p53S三基因突变的小鼠,TM）与G1-G5DM（Terc、Wrn双基因突变,DM）小鼠寿命、肿瘤发生率、组织器官衰老表型等揭示p53S对Wrn综合征导致的动物水平衰老的调控作用,主要结论如下:1)p53S对Wrn综合征小鼠寿命的影响。在小鼠端粒较长的早期代数,G1-G3DM小鼠的寿命要长于G1-G3TM。进一步分析发现,G1-G3TM小鼠早期死于肿瘤,导致寿命缩短;在小鼠端粒较短的晚期代数,G4-G5DM的寿命则短于G4-G5TM,同时在G4-G5TM小鼠中肿瘤发生率很低。这些数据提示,p53S对衰老相关表型的调控作用取决于端粒的长度。2)p53S对Wrn综合征小鼠体内组织器官衰老相关退行性变化的影响。G1-G3代的小鼠,DM与TM的小鼠体型、外观没有明显的区别,而G4、G5DM小鼠的体型明显小于TM,提示p53S缓解了Wrn综合征导致的小鼠生长迟缓。G5DM小鼠的睾丸内部结构严重空泡状,初/次级生精小管形态消失,而G5TM小鼠睾丸的内部结构正常。与DM小鼠相比,G5TM小鼠小肠绒毛细胞的增殖能力明显提高,G5TM小鼠的骨骼密度明显高于G5DM。这些数据表明,p53S可以延缓Wrn综合征的衰老表型,阻止衰老进程导致的器官组织退行性变化。3)在G1-G3TM小鼠中出现肿瘤和多囊肾（PKD）伴随发生。对肿瘤组织和PKD肾脏组织的RNA-Seq数据分析发现,肿瘤和PKD组织都激活了线粒体能量代谢通路、补体通路、脂质代谢通路,提示这些通路的调控可能是导致肿瘤和PKD的共同因素。我们进一步发现,p53S可以下调Pkd1/2,Pkhd1和Hnf1b,最终导致PKD的发生。这些数据发现了p53突变获得了调控PKD通路的新功能,首次在小鼠水平证实了肿瘤与PKD发生的关联性。为了进一步研究p53S调控Wrn综合征的衰老作用的分子机制及其对端粒长度的调控,我们利用G1,G3,G5DM和TM的MEFs,从细胞水平分析p53S调控Wrn综合征的分子通路。结果发现:1)p53S通过调控细胞周期,增殖,染色体整倍性等,来干预Wrn综合征诱导的衰老表型。p53S缓解了Wrn综合征诱导的细胞生长抑制。在p53S和G1TM细胞中存在G2/M阻滞,染色体出现多倍体,断裂,交叉等畸变现象。细胞凋亡的数据表明,G1TM,G3TM细胞的凋亡信号强于G1DM,G3DM细胞。根据端粒长度的数据,我们得出p53S启动了维持Wrn综合征端粒延长的替代机制,缓解了因端粒缩短导致的衰老。端粒延伸机制通常与肿瘤发生密切相关,我们仍对G1-G5TM细胞的成瘤性进行验证,结果TM细胞的致瘤性较低。综上所述,p53S通过增强细胞增殖能力,调控细胞周期及染色体整倍性,启动端粒延长机制来缓解Wrn综合征诱导的端粒功能异常所致细胞衰老表型。2)p53S通过调控DNA损伤、DNA复制及细胞周期相关通路来影响Wrn综合征细胞的衰老进程。为了研究p53S调控Wrn综合征细胞衰老进程的分子通路,我们收集了WT,p53S/S,G1DM,G3DM,G5DM,G1TM,G3TM,G5TM的MEFs,进行了RNA-seq分析。我们发现在G1-G5TM细胞中野生型p53诱导的DNA损伤应答通路活性逐渐增强。同时,DNA修复通路活性在G1-G5TM细胞中也逐渐增强,表明p53S促进了DNA损伤修复。另外,另一癌基因Rb调控的细胞周期相关基因在p53S和G1TM中被显著富集。p53S促进DNA复制和修复相关蛋白的高表达,可能激活DNA损伤修复、端粒维持等机制,进而保护细胞功能的正常运行。数据提示,p53S在端粒损伤较弱时（G1）增强了损伤应激反应。根据ssGSEA数据分析结果,我们对p53S细胞中G2/M周期调控相关基因和蛋白的表达验证,数据显示:相比于WT和p53null,在p53S细胞中Wee1,Birc5,Brca2,Cdc2,Cdk6,PolE,PolQ,Bard1,Gins2,Ube2C,Chk2和Cdc25C明显高表达;Western blot数据表明,相比于WT和p53null细胞,在p53S细胞中蛋白CDC25,p-CDC25,Weel,p-Cdc2,Cdk2和Cdk6高表达,同时DNA复制,修复和损伤相关的蛋白PolE,Rad51,Gins,Bard1,Survivin,γ-H2AX,CHK1/2和p-CHK1/2在p53S中高表达。数据证实,p53S通过G2/M监测点和有丝分裂纺锤体监测点调控细胞周期和染色体的畸变,其生物学后果有待进一步研究。最后,我们初步探索p53S调控细胞应答环境氧化应激的作用。结果表明,H2O2处理诱导野生型（WT）细胞出现大量的衰老细胞,而携带p53S突变的细胞则较少发生衰老,提示p53S可能影响细胞氧化应激导致的衰老进程,其分子机制有待进一步研究。综上所述,我们发现突变p53S可能通过调控DNA损伤修复、启动细胞端粒维持机制等,缓解端粒损伤诱导的衰老进程,从而延缓Wrn综合征小鼠的衰老进程。我们在机体整体水平上验证了衰老与肿瘤相互制约,相互平衡的调节机制,为临床衰老相关疾病及肿瘤的预防和治疗提供新的思路。