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储粮害虫一直是储粮过程中面临的重大难题,对农产品的数量以及质量都有严重影响,有效防治储粮害虫的新技术研究一直以来颇受各国科研人员的重视。玉米象作为重要的储粮害虫,在全世界范围内都对农产品储藏具有巨大威胁。磷化氢是现今世界范围内应用最广的熏蒸剂,在减少农产品储藏损失损耗和防治储粮害虫方面发挥了积极的作用。然而由于长期不合理的使用,导致储粮害虫对磷化氢的抗性问题已经严重限制了它们的应用,故寻找新型生物合理性熏蒸剂显得迫在眉睫。辣根素来源于十字花科植物的,是硫代硫酸酯类化合物的一种水解产物,对储粮害虫具有显著的熏蒸活性,具有进一步开发利用的价值。为了更高效合理的开发和利用辣根素作为熏蒸剂,本研究以玉米象为供试昆虫,从生物活性验证,组织病理学研究及生化与分子生物学水平,辣根素对玉米象线粒体结构与功能影响,研究了辣根素熏蒸引起的玉米象体内转录组水平的变化,并利用RNAi技术验证了线粒体基因nd5,nd6,cox1和cox5与辣根素对试虫熏蒸致死作用的关系,本研究所取得主要结果如下:1.测定了辣根素对玉米象的熏蒸活性,观察试虫中毒症状进行了及组织病理学水平的变化。结果表明:(1)在三角瓶熏蒸条件下,辣根素对玉米象试虫具有显著的熏蒸活性,LC50为0.74μg/ml(72h)。熏蒸放大研究也证明了辣根素具有实际应用价值。(2)辣根素熏蒸后,试虫的中毒症状主要分为:兴奋、痉挛、麻痹和死亡4个阶段。(3)透射电镜观察结果表明中毒试虫线粒体结构受到显著破损,线粒体内膜结构出现明显的空泡化。2.比较了辣根素和磷化钙熏蒸作用对玉米象试虫线粒体呼吸链及下游ROS的影响。结果表明:(1)在相同致死浓度下,辣根素与磷化钙熏蒸对玉米象试虫线粒体能产生类似的影响,对线粒体复合物I和IV都有一定的抑制作用。(2)辣根素和磷化钙熏蒸对试虫复合体IV的抑制作用基本一致,都伴随有剂量效应,LC25,LC50和LC75浓度处理下,AITC对线粒体复合体IV的抑制效果分别为20.04%,37.47%和54.32%,而磷化钙熏蒸所产生的抑制效果则分别为22.61%,50.65%和69.04%。同时两种化合物对复合体IV的抑制效果也伴随有时间效应,随着处理时间的增加,所产生的抑制效果越显著。而对复合体I的影响却不尽相同,辣根素熏蒸所产生的抑制作用伴随有剂量效应,LC25,LC50和LC75浓度处理下,复合体I的活性分别降低14.25%,17.17%和37.68%,而磷化钙熏蒸所产生的抑制作用却无明显的剂量效应。随着处理时间的增加,两种化合物对复合体I的抑制效果愈加显著。(3)辣根素熏蒸对线粒体呼吸链的抑制效果会引起试虫体内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的产生和累积,并对ROS相关酶系有不同的影响。其中过氧化氢酶(catalase,CAT)和过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性在辣根素熏蒸后会受到抑制,而超氧化物歧化酶(Superoxidase,SOD)被激活。3.对玉米象试虫的转录组信息进行了研究,并对辣根素熏蒸引起的试虫体内转录组水平变化进行了测序及分析。结果表明:(1)在玉米象试虫转录组测序研究中,组装匹配后共得到31,041条独立基因(unigenes)。对辣根素熏蒸所引起的试虫体内差异表达基因进行了统计,共得到388个差异表达基因,其中表达量上调的基因有117个,表达量下调的占271个。(2)对差异表达基因进行GO聚类分析分析发现,这些差异表达基因可分配至38个GO terms,其中大部分集中在“Binding”,“Cell process”和“metabolic”。KEGG聚类分析发现大部分差异表达基因被富集至“Folding,sorting and degradation”,“Transport and catabolism”,“Energy metabolism”和“Carbohydrate metabolism”。(3)qRT-PCR研究发现,辣根素熏蒸能够降低试虫体内cat基因表达量,而cuznsod表达量却有显著提高。4.为验证编码呼吸链复合体I和IV的线粒体基因nd5,nd6,cox1和cox5在辣根素熏蒸致死过程中的作用,本研究采用了RNAi技术降低基因的表达量,测定辣根素对基因表达量下降试虫的熏蒸活性及下游ROS效应。结果表明:(1)nd5,cox1 and cox5 RNAi处理后,玉米象试虫的生存能力受到明显抑制,其中抑制试虫体内cox1基因表达量,其生存能力所受抑制最为显著,而降低试虫体内nd6基因表达量对试虫生存能力与未进行RNAi处理试虫相比,则无显著变化。(2)辣根素对cox1 RNAi处理试虫熏蒸活性较未经RNAi处理试虫降低19.07%,而对nd6 RNAi处理试虫熏蒸活性较未经RNAi处理试虫则提高25.53%。(3)辣根素熏蒸对试虫体内线粒体依赖型ROS有明显提高作用,而AITC熏蒸对RNAi处理试虫体内ROS也有不同的影响:其中cox1 RNAi处理试虫熏蒸后,体内ROS比未经RNAi处理试虫有所下降,但仍比未熏蒸试虫显著提高,而nd6RNAi处理试虫熏蒸后,体内ROS比未经RNAi处理试虫会进一步增加。综上所述,辣根素具有进一步开发为生物熏蒸剂的潜力,可以作为磷化氢的替代品。本研究推测辣根素对玉米象的熏蒸作用机理为:辣根素与线粒体复合体I和IV结合,并抑制其活性,导致氧还原不彻底,体内产生活性氧自由基,在CAT和POD活性受抑制,而SOD活性被提高的情况下,会进一步导致氧自由基的过度累积,从而引起线粒体膜脂过氧化,最终致死。其对各代谢途径的具体影响,仍有进一步研究价值。