天然免疫是宿主抵抗病原微生物感染的第一道防线,也是激活获得性免疫的基础,在机体清除病原微生物的免疫反应中起着关键的作用。TRIM（Tripartite motif）家族蛋白是一类宿主限制性因子,其可以直接影响病毒复制周期,或者通过调节免疫信号分子而在抗病原微生物天然免疫方面发挥重要作用。近年研究发现内源性TRIM15具有抗病毒和调节天然免疫的功能;在细胞中下调内源性TRIM15后能增强MLV和HIV-1的组装和释放。TRIM15依赖RIG-I信号通路正调控I型干扰素的产生且作用于接头蛋白MAVS（mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS）的上游,但是与RIG-1通路中的接头分子均没有相互作用,因此TRIM15调控IFN-β产生的分子机制目前尚不清楚。鉴于此,本研究通过免疫沉淀联合蛋白质质谱技术钓取与TRIM15互作的宿主蛋白并阐明其在TRIM15调控IFN-β的作用,具体研究内容如下:1.TRIM15对I型干扰素产生的影响有研究表明沉默TRIM15下调IFN-β的产生,为了验证TRIM15对IFN-β的调控效应,利用双荧光素酶报告系统和荧光定量PCR实验进行验证,结果表明过表达TRIM15能增强IFN-βm RNA的转录水平;Western blot结果也表明TRIM15能增加IFN-β上游分子IRF3（interferon regulatory factor 3,IRF3）的磷酸化水平。空斑实验表明过表达TRIM15能够抑制VSV的增殖;这些结果表明过表达TRIM15能有效促进IFN-β的产生。2.与TRIM15互作宿主蛋白的钓取与验证为了探讨TRIM15调控IFN-β的分子机制,利用慢病毒表达系统获得稳定表达TRIM15的293T细胞系,通过免疫沉淀和蛋白质质谱分析钓取与TRIM15发生相互作用的宿主蛋白。结果表明定位于线粒体的酮戊二酸脱氢酶（OGDH）可被重复钓取。利用CO-IP实验证实了TRIM15与OGDH存在相互作用;然而据报道OGDH定位于线粒体内膜,而TRIM15定位于细胞质。为了研究二者的空间定位,我们进行了线粒体分离实验,结果从线粒体中成功分离出TRIM15;激光共聚焦观察发现TRIM15与OGDH在细胞内存在共定位现象。互作结构域的实验表明TRIM15的PRY-SPRY结构域和卷曲螺旋结构域是TRIM15与OGDH发生互作的关键结构域;然而并未找到OGDH与TRIM15的互作结构域。3.OGDH在TRIM15调控I型干扰素产生中的作用为了确定TRIM15和OGDH的相互作用是否影响蛋白表达量,在293T和A549细胞中过表达TRIM15,Western blot结果表明过表达TRIM15能降解内源性OGDH。但是将不同剂量的TRIM15-HA与OGDH-Flag共转染293T细胞后,Western blot结果表明TRIM15对外源性的OGDH没有降解作用。将TRIM15不同缺失体分别转染293T细胞,Western blot结果显示TRIM15的RING结构域不是降解OGDH的关键结构域,但其关键结构域尚未确定。TRIM蛋白的RING常具有E3泛素连接酶的活性,为了探究TRIM15的RING结构域是否具有E3泛素连接酶活性及此种活性是否影响OGDH的降解效应。我们检测了TRIM15和OGDH的泛素化功能。免疫沉淀实验表明TRIM15和OGDH都能发生自身泛素化,且缺失RING结构域会削弱TRIM15的泛素化程度。进一步研究结果显示TRIM15并不影响OGDH的泛素化程度,这表明TRIM15不是OGDH的E3泛素连接酶。为了进一步探讨TRIM15降解OGDH的途径,分别用蛋白酶体抑制剂（MG132）、自噬抑制剂（3-MA）和溶酶体抑制剂（NH4CL）处理细胞,结果表明NH4CL处理后将恢复TRIM15降解的OGDH,这表明TRIM15依赖溶酶体途径降解OGDH。TRIM15可降解OGDH,那么沉默OGDH在TRIM15调控干扰素中发挥怎样的作用呢?我们利用实时荧光定量PCR和双荧光素酶活性实验表明沉默OGDH能上调IFN-β的表达,Western blot实验表明沉默OGDH可显著上调p IRF3的表达。由此可见,沉默OGDH能上调IFN-β的产生。本研究结果表明,过表达TRIM15上调IFN-β的产生,且TRIM15依赖溶酶体途径降解其宿主蛋白OGDH,而沉默OGDH亦可上调IFN-β的产生。因此,我们猜测TRIM15可能通过降解OGDH进而上调IFN-β。