【摘 要】
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ATP是在所有活的生物体中普遍存在的一种化合物,是细胞内最直接的能源物质,可参与到细胞的物质代谢以及能量代谢的过程中。90年代动物细胞质膜表面中就有发现多种胞外ATP所引起的各种生理生化反应的受体,统称为嘌呤受体,根据其本质和功能分为P1和P2这两种类型的受体。虽然研究证实植物也可以响应e ATP并产生一些生理变化,如细胞中钙浓度的增加和植物抗逆反应,但在植物体中并没有找到与动物中受体同源的基因。
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ATP是在所有活的生物体中普遍存在的一种化合物,是细胞内最直接的能源物质,可参与到细胞的物质代谢以及能量代谢的过程中。90年代动物细胞质膜表面中就有发现多种胞外ATP所引起的各种生理生化反应的受体,统称为嘌呤受体,根据其本质和功能分为P1和P2这两种类型的受体。虽然研究证实植物也可以响应e ATP并产生一些生理变化,如细胞中钙浓度的增加和植物抗逆反应,但在植物体中并没有找到与动物中受体同源的基因。Stacey实验室通过筛选胞内钙离子浓度增加不敏感突变体,克隆得到了植物胞外ATP受体蛋白—DORN1。DORN1编码一个Malectin膜受体激酶。本课题与Stacey实验室合作开展了DORN1受体蛋白介导ATP信号的的分子机制研究。利用质谱分析、免疫沉淀等方法分析DORN1的磷酸化位点、关键磷酸化位点S391的抑菌能力以及DORN1的表达调控机制。主要研究结果如下:1.通过提取DORN1激酶域蛋白进行体外磷酸化实验,通过质谱分析鉴定了6个可能的磷酸化位点,即S345;S375;S391;S440;S451;T458A;S472。2.将这7个位点分别突变成丙氨酸（不能被磷酸化的形式）和天冬氨酸（模拟磷酸化的形式）,再把这些点突变的DORN1分别转化到DORN1的T-DNA插入缺失突变体dorn1-3中,并获得转基因植株。通过测定Ca2+浓度确定了可能具有功能的磷酸化位点,即S391、S451、S440。3.在大肠杆菌中表达DORN1激酶域的研究发现,DORN1S391D的激酶域与野生型DORN1相比,可明显抑制抑制大肠杆菌的生长,推测可能参与调控植物抗病反应。4.把DORN1连入带35S启动子的HA和MYC标签载体并在原生质体瞬时表达,免疫共沉淀实验发现DORN1受体会发生自聚合的现象,即可能是以二聚体的形式起作用的。5.通过酵母双杂交实验筛选出了与DORN1互相作用的蛋白,筛选到的蛋白主要包括叶绿体局部硫氧还蛋白、核糖体蛋白家族蛋白、重金属转运/解毒超家族蛋白、钙调磷酸酶金属磷酸酯酶超家族蛋白等我们的研究不仅揭示了DORN1蛋白激酶域具有功能的3个有功能的磷酸化位点,筛选得到了与DORN1互作的蛋白,也发现了磷酸化位点突变体S391的模拟磷酸化突变(DORN1S391D),可抑制大肠杆菌的生长。我们推测该位点可能在DORN介导的植物免疫中起到重要作用。本研究探索DORN1在植物抗逆中的重要作用机制,这可能对于作物抗逆育种有很大的指导作用。
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