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【目的】脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)常导致损伤节段以下肢体感觉运动功能丧失,严重影响患者的生活质量。以炎症反应为主的继发性损伤是SCI后神经退变的主要原因,且调节损伤局部炎症反应,减少其有害效应,可促进脊髓损伤修复。非甾体抗炎药(Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs,NSAIDs)通过抑制环氧化酶而减少其下游炎症因子产生,被广泛用于各种炎症相关疾病的治疗。在SCI治疗方面,NSAIDs可通过抑制Rho A通路,减少神经元凋亡、促进轴突再生,最终改善SCI后的神经功能。萘普生(Naproxen,Npx)作为一种经典NSAIDs,口服应用后可改善SCI小鼠的运动功能,亦可通过抑制Rho A通路减轻大鼠SCI后的神经退变。虽然Npx对SCI修复有一定作用,但是效果较弱,可能与其对环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)的选择性较低、脊髓损伤局部药物浓度过低有关。通过将萘普生与D构型氨基酸共价连接使其在水中自组装成超分子载药水凝胶(Drug-Loaded Supramolecular Hydrogel,DLSH,NanoNpx),形成的DLSH对COX-2选择性提高20倍,且在局部应用中能够稳定、持久的释放具有生物功能的凝胶因子。本课题旨在探究局部应用超分子载药水凝胶对SCI后损伤部位的炎症反应、巨噬细胞极化状态以及神经功能的影响。【实验方法】1.实验动物及分组:本实验采用16周龄,体重220g左右的Wister大鼠,随机分为4组:对照(Sham)组、单纯损伤(Injury)组、萘普生组(Npx)、超分子载药水凝胶组(Nano-Npx),每组8只。2.动物模型制作:给予Sham组的大鼠单纯T10椎板咬除术,应用纽约大学打击器(New York University impactor,NYU impactor)对其余3组动物建立中等程度脊髓挫伤模型,打击锤质量为10g,打击高度为25 mm。3.给药方式:分别于损伤后立即向Nano-Npx组、Npx组损伤脊髓的硬膜外覆盖超分子载药水凝胶或萘普生。以同样的方式给予Injury组和Sham组等量的生理盐水治疗。4.功能及组织病理学评价:分别于损伤前,损伤后1天,7天,14天,21天,28天对各组实验动物进行BBB评分(Basso,Beattie,and Bresnahan Scale,BBB评分),以评价其运动功能;于脊髓损伤后第28天对各组大鼠进行MRI扫描以评估损伤面积;完成MRI扫描后处死各组大鼠,获取其脊髓组织并制作石蜡切片。分别对获取的组织进行苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE染色)、劳克坚牢蓝(Luxol Fast Blue,LFB)染色和尼氏(Nissl)染色以评价脊髓空洞面积、有效神经纤维数量、存活神经元数量。5.Nano-Npx修复脊髓损伤的机制研究:利用抗原抗体特异反应,分别对脊髓组织的胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)、神经元核心抗原(Neu N)、CD68(巨噬细胞特异抗原)、离子钙结合衔接分子-1(Ionized Calcium Binding Adapter Molecule 1,IBA-1)诱导型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase,i NOS)、精氨酸酶-1(Arginase-1,Arg-1)、COX-2进行免疫荧光染色,以观察超分子载药水凝胶对SCI后局部炎症反应、巨噬细胞活化状态的影响。【结果】1.行为学评价:从损伤后1周起,Nano-Npx组、Npx组的大鼠的BBB评分均显著高于Injury组(P<0.001,P<0.05),且Nano-Npx组大鼠评分显著高于Npx组(P<0.01),之后三周呈同样趋势。2.MRI评价:损伤后第4周的Nano-Npx组、Npx组脊髓组织T2像高信号区面积显著小于Injury组(P<0.001,P<0.05),此外,Nano-Npx组的T2高信号区面积显著小于Npx组(P<0.05)。3.组织病理评价:HE及GFAP免疫荧光染色结果显示,与Injury组相比,超分子载药水凝胶可显著减少SCI后空洞面积及胶质瘢痕的形成(P<0.05)。LFB、Nissl染色结果表明,Nano-Npx组有效神经纤维数量、存活神经元数量均显著高于Npx组和Injury组(P<0.01,P<0.001)。4.修复机制:与Npx组、Injury组相比,Nano-Npx可明显减少损伤局部巨噬细胞数量、小胶质细胞数量和反应型星形胶质细胞数量(P<0.05),并显著下调三者COX-2(P<0.05)的表达。此外,对不同巨噬细胞亚型分析发现,NanoNpx还可下调损伤局部M1型巨噬细胞数量,上调M2型巨噬细胞的数量。【结论】1.本研究证实超分子载药水凝胶可减轻脊髓损伤后神经组织退变,改善脊髓损伤大鼠的运动功能。2.超分子载药水凝胶通过减少损伤局部活化小胶质细胞、巨噬细胞和反应性星形胶质细胞的数量,下调各炎症细胞内COX-2的表达,促进巨噬细胞向M2型活化,抑制其向M1型活化,从而减轻SCI后炎症反应,促进脊髓损伤修复。3.本研究为超分子载药水凝胶促进中枢神经系统的再生修复提供了实验证据,为脊髓损伤的修复提供了新策略。