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目的通过构建驼源天然噬菌体纳米抗体展示文库,并对展示文库进行鉴定,以期作为可以筛选不同靶标抗原分子的通用筛选平台。同时,以艰难梭菌谷氨酸脱氢酶（GDH）作为抗原靶标,筛选靶向GDH的纳米抗体,并对纳米抗体进行表达、纯化及验证。方法1提取双峰驼的脾脏组织总RNA,并采用Oligo dT进行反转录,根据NCBI数据库查询得到骆驼重链可变区序列,并根据其两端恒定区序列设计两对特异性巢氏PCR引物。通过巢氏PCR获得全套的重链可变区基因,并将扩增的基因通过酶切、连接、DNA纯化重组构建到pCANTAB5e噬菌体展示载体,再电转到大肠杆菌TG1中。然后,通过KM13辅助噬菌体的拯救构成驼源天然噬菌体纳米抗体展示文库,并通过对文库的库容和多样性以及片段插入率的鉴定来检验文库质量。2.对GDH抗原进行原核表达和镍柱纯化,以GDH抗原为靶标包被96孔板,加入噬菌体展示文库进行筛选。通过三轮“吸附-洗脱-扩增”淘筛过程,计算每一轮筛选后的洗脱量和回收率,评价富集程度,最终获得能够与GDH抗原特异性结合的含有目的基因的噬菌粒。其次,挑选第三轮筛选后平板的单克隆菌落制备噬菌体多克隆上清并进行Phage-ELISA鉴定,然后从中挑选吸光度值较高的重新制备噬菌体单克隆上清,并进行第二轮Phage-ELISA鉴定,最终获得阳性单克隆并测序获得基因序列。3.将目的基因VHH序列以及人源Fc段构建至PET30a表达载体,通过原核表达系统表达含有人源Fc片段的抗GDH重组纳米抗体,同时经过Ni柱系统纯化后获得纯化抗体。并采用SDS-PAGE和Western Blot对所获得的抗体蛋白进行分析验证。结果1.成功构建双峰驼源天然噬菌体纳米抗体展示文库,对文库的库容和多样性进行鉴定,结果显示,构建的文库片段插入阳性率为95%左右,随机挑取的9个克隆的氨基酸同源性为66.17%,且经BLAST比对后均为骆驼重链抗体可变区,MEGA构建系统进化树分析后具有较好的多样性。同时,初级文库经过KM13救援后测定,噬菌体展示文库的滴度为4×1012 CFU/ml。2.以GDH抗原为靶标对噬菌体文库经过三轮淘筛后,通过计算表明,噬菌体得到了有效的富集,回收率逐渐增加。制备噬菌体单克隆后,通过ELISA鉴定,以实验孔与阴性值之比大于3作为阳性值,从中选取吸光度值较高的单克隆进行测序,并最终得到两条抗GDH的纳米抗体序列,分别命名为抗GDH-01和抗GDH-02。3.将获得的VHH序列克隆至PET30a表达载体进行原核表达后,经过SDS-PAGE分析表明该重组蛋白为包涵体表达,用抗His标签抗体对重组蛋白进行Western Blot验证,结果大小约为45kDa左右。将带有His标签重组蛋白经过镍柱纯化,然后以重组纳米抗体作为一抗,抗人IgG/HRP作为酶标二抗进行Western Blot分析验证。结果显示,该重组纳米抗体可以与GDH抗原进行特异性结合,最终纯化获得8mg抗GDH纳米抗体。