蛋黄卵磷脂活性组分的分离纯化及其辅助增强记忆功能研究

来源 :大连工业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:fengfeiyuren
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卵磷脂作为植物和动物生物膜的主要组成成分,具有很多生理活性功能,如调节脂质代谢,预防心血管疾病,增强大脑功能等。我国作为禽蛋产销大国,有必要对蛋黄卵磷脂及其活性组分进行深入研究,为禽蛋高值化应用提供技术支撑。基于此,本研究采用有机溶剂提取技术结合单因素和响应面方法优化蛋黄卵磷脂提取工艺,基于BABL/C动物模型研究蛋黄卵磷脂辅助增强记忆功能,同时利用硅胶柱层析技术纯化蛋黄卵磷脂PC和PE,并利用体外PC12细胞模型研究蛋黄卵磷脂及其活性组分辅助增强记忆功能和神经保护作用。研究结果如下:(1)蛋黄卵磷脂提取工艺优化。采用乙醇-正己烷混合溶剂(萃取)和丙酮(沉淀)联合提取蛋黄卵磷脂,基于HPLC-ELSD技术以PC和PE的含量为指标,采用单因素和响应面技术优化蛋黄卵磷脂提取工艺。研究表明在乙醇浓度91.1%和提取温度39.5 oC条件下提取得到的PC含量最高(226.78±0.18μg/mL)。在乙醇与正己烷的溶剂比为4.6:1、提取温度为40.7 oC、乙醇浓度为98%条件下,提取得到PE含量最高(56.91±0.14μg/mL)。(2)基于动物模型研究蛋黄卵磷脂辅助增强记忆功能。通过构造小鼠痴呆模型,以行为学实验和酶活测定以及脑组织病理学染色为评价指标对比分析蛋黄卵磷脂改善记忆力的活性。行为学实验(水迷宫和避暗实验)结果表明摄入蛋黄卵磷脂的小鼠潜伏时间和错误次数相比于模型组显著减少(P<0.05)。脑组织中与记忆相关的酶类测定结果表明蛋黄卵磷脂能显著下调乙酰胆碱酯酶(AChE)活力并上调乙酰胆碱转移酶(ChAT)活力(P<0.05)。脑组织苏木精-伊红染色(HE)结果显示卵磷脂组与模型组相比大脑皮层和海马区的细胞萎缩状态有所恢复。在此基础上,通过血液指标、小鼠体成分实验以及小鼠肝脏和结肠HE染色证明蛋黄卵磷脂在实验条件下对小鼠的血糖和血脂无显著影响。动物实验结果说明蛋黄卵磷脂在不影响血糖和血脂条件下通过下调AChE活力和上调ChAT活力达到增强记忆力的效果。(3)蛋黄卵磷脂活性组分分离纯化及结构解析。基于研究发现蛋黄卵磷脂具有辅助增强记忆功能,因此本章利用硅胶柱层析技术纯化蛋黄卵磷脂活性组分PC和PE,为后续蛋黄卵磷脂活性组分PC和PE活性研究提供基础。结果研究发现用体积比18:5:1的氯仿-甲醇-乙酸三元混合溶剂作为洗脱剂,利用等度洗脱模式,可成功纯化PE,其纯度达到98%。利用梯度洗脱模式,先使用体积比18:5:1的氯仿-甲醇-乙酸三元混合溶剂A洗脱,后用极性更大的体积比10:5:1的氯仿-甲醇-乙酸三元混合溶剂B洗脱,成功纯化PC,其纯度达到98%。利用MALDI-TOF-MS和GC-MS鉴定和解析PC和PE分子结构。PC的分子结构为16:0/16:0-PC,16:0/16:1Δ9-PC,16:0/18:0-PC,16:0/18:1Δ9-PC,16:0/18:2Δ9,12-PC,18:0/18:1Δ9-PC,18:0/18:2Δ9,12-PC,18:1/18:2Δ9,12-PC和18:0/20:4Δ5,8,11,14-PC。PE的分子结构为16:0/18:1Δ9-PE,16:0/18:2Δ9,12-PE,16:0/20:4Δ5,8,11,14-PE,18:0/18:1Δ9-PE,18:0/18:2Δ9,12-PE和18:0/20:4Δ5,8,11,14-PE。(4)基于PC12细胞模型研究蛋黄卵磷脂及其活性组分的神经保护作用。利用电子顺磁共振(EPR)技术通过对PC和PE清除DPPH自由基能力测定评价其抗氧化活性。结果发现PC和PE能显著降低DPPH自由基的EPR信号强度,且其清除能力与剂量呈正相关。在此基础上,利用莨菪碱构造PC12细胞氧化损伤模型,通过测定AChE活性、单胺氧化酶(MAO)活力和丙二醛(MDA)含量研究蛋黄卵磷脂及其活性组分的神经保护作用。结果发现,4 mg/mL莨菪碱处理PC12细胞4 h后其细胞活力为50.30±2.65%,是最适的损伤模型。使用浓度为0.2 mg/mL的蛋黄卵磷脂、标准品PC、纯化PC、标准品PE、纯化PE对PC12细胞预保护24 h,与莨菪碱氧化损伤组比较,细胞内AChE活性、MDA含量和MAO活力显著降低(P<0.05)。实验结果表明蛋黄卵磷脂及其活性组分PC和PE能通过抑制莨菪碱诱导PC12细胞产生的神经毒性和氧化应激发挥神经保护作用。上述结果说明,蛋黄卵磷脂及其活性组分可以通过下调AChE活性抑制莨菪碱诱导产生的神经毒性以及通过下调MDA含量和MAO活力抑制莨菪碱诱导的氧化应激发挥神经保护作用,进而达到辅助增强记忆功能,是缓解记忆障碍的潜在营养物质。
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