目的：细胞凋亡,又称程序化死亡,是指为维持内环境稳定,在多种基因调控下的一个严密完整的、主动的、有序的死亡过程,是为了更好的适应生存环境而主动争取的一种死亡过程,涉及系列基因活化、表达及调控等作用。Fas(CD95/APO-1)是TNF受体超家族成员,通过与Fas配体或者抗Fas抗体(CH11)结合介导程序化死亡过程。当Fas与Fas配体(FasL)或者抗Fas抗体结合后,诱导Fas分子聚集形成三聚体,通过其胞浆内的死亡结构域(death domain,DD)与Fas相关的死亡结构蛋白(Fas-associated death domain protein,FADD)结合,形成死亡受体诱导的信号复合体(DISC)。DISC可以活化启动型caspase分子,如caspase-8和caspase-10,这些启动型caspase分子可以进一步活化效应型caspase分子,如caspase-3和caspase-7,介导细胞凋亡。　　 伊立替康(Irinotecan),也称为CPT-11,是一种半合成的喜树碱(Camptothecin)类似物,喜树碱最初是从中国西藏的一种观赏性植物喜树中分离提取的。伊立替康通过抑制拓扑异构酶Ⅰ(topoisomeraseⅠ,TopoⅠ)选择性杀伤S期细胞,因此伊立替康被用作为一种抗癌药。目前,伊立替康已经具有了广泛的抗肿瘤谱,对其敏感的肿瘤有结肠直肠癌、食道癌、胃癌、非小细胞和小细胞肺癌、淋巴瘤和白血病,以及中枢神经系统的恶性胶质瘤。SN38(10-hydroxy-7-ethyl-camptothecin),是CPT-11的活性代谢产物,其作用于核酶TopoⅠ,使双链DNA裂解并最终导致细胞死亡。SN38的作用强度至少是CPT-11的1000倍,并且具有更广泛的抗肿瘤谱。　　 T细胞淋巴瘤是一种生物学上具有异质性的并且不常见的非何杰金淋巴瘤。该肿瘤侵袭性强,病人预后不好,五年生存率仅为15-30％。T细胞淋巴瘤在术后非常容易复发,并且表现出对各种治疗手段很强的抵抗性。目前,对于该肿瘤并没有一个普遍推荐的标准治疗方案。因此,急需建立一个新的,有效的联合化疗方案。　　 脂筏是细胞膜上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域(microdomain)。鞘磷脂(sphingomyelin,SM)是脂筏的重要组成成分。神经酰胺(ceramide)在鞘磷脂合成酶(sphingomyelin synthesis,SMS)的催化作用下合成鞘磷脂和甘油二酯(diacylglycerol,DAG),鞘磷脂合成酶有SMS1和SMS2两种。WR19L是转入了人类Fas基因的小鼠T淋巴瘤细胞株,实验发现在wR19L中一部分细胞为SM缺陷型细胞。我们将SMS1基因与pLIB表达载体连接(SMS1-pLIB),经VSV-G逆转录病毒包裹后转入SM缺陷型WR19L细胞,形成SMS表达(WR/Fas-SMS1)细胞,用同样方法将空载体pLIB转入SM缺陷型WR19L细胞,形成SMS非表达[WR/Fas-SM(-)]细胞。最近的一些研究表明,在Fas介导的凋亡过程中,Fas可以易位和聚集于脂筏所在区域,脂筏通过促进DISC的形成进而活化caspase依赖的细胞死亡途径。并且,一些实验结果也显示SN38诱导肿瘤细胞死亡的机制之一就是诱导肿瘤细胞凋亡。然而,目前包括肠癌和肺癌在内的越来越多的肿瘤表现出了对伊立替康及其中间代谢产物的抗药性,这使得伊立替康与其他化疗药物联合应用成为必须。因此为深入探讨SN38与Fas介导凋亡的相互关系以及T细胞淋巴瘤的联合化疗方案,本实验通过单独或者联合应用SN38和CH11(Fas抗体)作用于脂筏阴性和脂筏阳性的T细胞淋巴瘤细胞株WR/FAS-SM(-)细胞和WR/FAS-SMS1细胞,观察SN38能否促进Fas介导的凋亡以及对两种细胞的效应差异,并进一步探讨脂筏在该过程的作用。　　 方法：　　 1、细胞复苏　　 从液氮中取出WR/FAS-SM(-)细胞和WR/FAS-SMS1细胞,迅速放入37℃水浴中,待完全溶化后,将细胞分别转入已盛好10ml10％FCS-1640培养液的离心管中,1200rpm,离心6min,弃上清。再于每管中加入10ml10％FCS-1640培养液,混匀后,将所有液体分别移至10cm无菌培养皿中,5％CO2,37℃培养。常规换液和传代。　　 2、刺激细胞　　 常规收集并且计数细胞,调整细胞浓度为5×10/ml,接种24孔板,每孔1ml。CO2细胞孵育箱中培养2小时后,加入不同浓度SN38和/或CH11刺激,混匀细胞后,继续放入CO2细胞孵育箱继续培养。　　 3、形态学观察刺激细胞12小时后,于倒置显微镜下观察,并于放大400倍时拍照记录。　　 4、FACS检测细胞凋亡分别收集细胞于1.5ml微量离心管中,离心,1200rpm,3min。弃上清,每管加100μl0.5％PFS(0.5％多聚甲醛,0.5％皂甙),再加入150μg/ml RNaseA50μl。室温放置30min,每管加入1ml PBS,混匀后离心,1200rpm,3min。弃上清,每管留50μl液体,再加入5μl200μg/ml PI,混匀后避光放置15min。再于每管加入500μl PBS,待流式细胞仪检测。　　 5、DNAladder检测按照Sigma Genelute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit说明书操作。提取DNA后,经1.5％琼脂糖凝胶电泳观察结果。　　 6、蛋白样品处理与Western Blot收集5×105个细胞,离心,1200rpm,3min,离心后弃上清。每管中加50μ llysing buffer,Vortex5-10s,剧烈震荡,置于冰上,30rain。4℃离心,10000rpm,10min。取上清与等体积的sample buffer混合,煮沸6min。常温离心,10000rpm,10min。上清即为电泳的蛋白样品。取处理后的蛋白样品15μl于每个泳道中,同时设一个泳道加入6μl Rainbow marker,经6％-15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,转移至PVDF膜上。用含有5％脱脂奶粉的TBS溶液封闭30min,用TBST液沈膜5min×3次,再用TBS液洗膜5min×1次后,加入100倍稀释的一抗,4℃过夜孵育。用TBST液沈膜5min×3次,再用TBS液洗膜5min×1次后,加入1000倍稀释的二抗,室温孵育30min。再次用TBST液洗膜5rain×3次,再用TBS液洗膜5min×1次后,加入ECL发光液,染色1min后,于暗室曝光显像。所有孵育过程均在透明的聚乙烯透明袋中进行。　　 7、统计学分析应用SPSS11.5统计学分析软件。用t检验进行显著性分析,P＜0.05为显著性差异。　　 结果：　　 1、SN38和/或CH11单独或共同作用对WR/FAS-SM(-)和WR/FAS-SMS1凋亡的影响WR/FAS-SM(-)和WR/FAS-SMS1经过不同浓度SN38和25ng/ml CH11刺激12小时后,对于WR/FAS-SM(-)细胞,SN38和CH11联合应用与SN38单独应用各浓度组相比,凋亡率未见显著性差异;对于WR/FAS-SMS1细胞,SN38和CH11联合应用与SN38单独应用相比,在SN3850nM浓度组出现凋亡率的差异,并且在该浓度组,两细胞之间的凋亡率出现了显著性差异。　　 2、SN38和CH11共同作用对WR/FAS-SM(-)和WR/FAS-SMS1的形态学改变WR/FAS-SM(-)和WR/FAS-SMS1经过SN38(50nM)和25ng/ml CH11共同作用12小时后,WR/FAS-SMS1的凋亡细胞数量明显多于WR/FAS-SM(-)。　　 3、SN38和CH11共同作用对WR/FAS-SM(-)和WR/FAS-SMS1DNA降解的影响经过SN38(50nM)和25ng/ml CH11共同作用12小时后,WR/FAS-SMS1细胞DNA的断裂程度明显强于WR/FAS-SM(-)细胞。　　 4、SN38和CH11共同作用对WR/FAS-SM(-)细胞和WR/FAS-SMS1细胞ATM、ATR活化水平的观察磷酸化ATM的表达水平在WR/FAS-SMS1细胞被50nM SN38和25ng/mlCH11共同作用后的0.5和1小时升高,而在WR/FAS-SM(-)细胞中,没有见到磷酸化ATM表达水平的升高。总ATM的表达水平在两种细胞中均未见明显升高;磷酸化ATR的表达水平在两种细胞中均未见明显表达。　　 5、SN38和CH11共同作用对WR/FAS-SM(-)细胞和WR/FAS-SMS1细胞Chk1活化水平的观察磷酸化Chk1在WR/FAS-SMS1细胞和WR/FAS-SM(-)细胞中的表达均呈现时间依赖关系,即在SN38和CH11共同作用后的1,3,6小时活化,在共同作用后的1小时和3小时表达水平最高。并且,在1小时和3小时的时间点,Chk1的活化状态在两细胞之间存在显著性差异。进一步实验显示,Chk1的活化由SN38而非CH11诱导。　　 6、SN38和CH11共同作用对WR/FAS-SM(-)细胞和WR/FAS-SMS1细胞p53活化水平的观察磷酸化p53在WR/FAS-SMS1细胞中的表达呈现时间依赖关系,即在共同作用后的3,10,14小时表达水平与未刺激组相比显著升高,并且在14小时达到峰值。在14小时时间点,磷酸化p53的表达水平在两细胞之间存在显著差异。但在WR/FAS-SM(-)细胞中,CH11和SN38的共同作用使p53活化,但我们没有见到时间依赖的关系。进一步实验显示,p53的活化由SN38而非CH11诱导。　　 7、SN38和CH11共同作用对WR/FAS-SM(-)细胞和WR/FAS-SMS1细胞p21活化水平的观察磷酸化p21的表达水平在WR/FAS-SMS1细胞被50nM SN38和25ng/ml CH11共同作用后随时间的延长而逐渐减弱,但是在WR/FAS-SM(-)细胞中,磷酸化p21的表达水平并没有表现出这种减弱的趋势。当50nM SN38单独作用于WR/FAS-SM(-)细胞和WR/FAS-SMS1细胞时,磷酸化p21的表达水平未见相似差异。　　 8、SN38和CH11共同作用对WR/FAS-SM(-)细胞和WR/FAS-SMS1细胞caspase-3活化水平的观察Caspase-3的活化水平在WR/FAS-SMS1细胞被50nM SN38和25ng/ml CH11共同作用后的3小时升高,而在WR/FAS-SM(-)细胞中,没有见到cleaved caspase-3表达水平的升高。　　 9、SN38和CH11共同作用对WR/FAS-SM(-)细胞和WR/FAS-SMS1细胞caspase-8活化水平的观察经过SN38和CH11的共同作用,cleaved caspase-8的表达水平在WR/FAS-SMS1细胞和WR/FAS-SM(-)细胞中都有所升高。并且,在共同作用0.5,1,3小时的时问点上,两细胞cleaved caspase-8的表达水平存在显著性差异。　　 10、SN38和CH11共同作用对WR/FAS-SM(-)细胞和WR/FAS-SMS1细胞caspase-2和caspase-7活化水平的观察经过SN38和CH11的共同作用0,0.5,1,3小时后,在WR/FAS-SMS1细胞和WR/FAS-SM(-)细胞中,均未见到caspase-2的有意义活化。经过50nM SN38和25ng/ml CH11共同作用,两种细胞中cleaved caspase-7的表达水平均升高,并且,在共同作用0.5,1,3小时的时间点上,WR/FAS-SMS1细胞caspase-7的活化水平要强于WR/FAS-SM(-)细胞。　　 结论：　　 1、一定浓度的SN38和CH11的共同应用与单独应用SN38相比能够促进WR/Fas-SMS1细胞的凋亡,但对WR/Fas-SM(-)细胞凋亡的促进作用不明显。　　 2、脂筏在SN38促进WR/Fas-SMS1细胞Fas介导凋亡过程中起到一定作用。　　 3、SN38和CH11的共同作用通过活化WR/FAS-SMS1细胞内ATM-Chk1-p53途径,导致p21活化水平降低,进而活化caspase-3,7,8,最终介导明显凋亡现象的发生;而在WR/FAS-SM(-)细胞中,Chk1和p53活化程度未能致p21的活化水平降低,因此,WR/FAS-SM(-)细胞的凋亡也就不明显。　　 4、CH11和SN38的共同作用下,脂筏可能是通过调控p21的不同活化状态最终导致了WR/FAS-SM(-)细胞和WR/FAS-SMS1细胞间凋亡率的差异。　　 5、CH11和SN38共同作用未见诱导WR/FAS-SMS1细胞和WR/FAS-SM(-)细胞ATR和caspase-2的活化。