血管内皮细胞(Endothelial cells,ECs)在调节血管功能和血管稳态上起关健作用,在血管损伤性疾病越来越发挥独特的优势,而对于变性的疾病血管方面的变化越来越被关注,成了研究的热点问题。其病理方面的改变大都是损伤处的内膜内皮细胞功能障碍,血管的异常物质沉积等,治疗的主要方向是修复受损的内皮以及血管的重建,成了这类疾病治疗的一个主要的方法。　　 AD病作为一种变性疾病目前在治疗上主要是药物,以及一些理疗,或者干细胞的植入方法,效果都不太理想,现在研究认为,本病主要是Aβ清楚障碍,是致病关键。所以从治疗的策略上选择了改善血管的功能,重建血脑屏障。目前对血管内皮功能的修复的研究侧重于基因和干细胞的研究。干细胞移植治疗作为治疗一些疾病的新策略,其目的就是替代,修复,加强受损组织或器官的功能改善。鉴于干细胞的具有强大的增殖能力以及具有明显的分化潜能,吸引了各个领域人士进行研究。　　 虽然神经干细胞(NSCs)移植治疗中枢神经系统退行性疾病表明,某些部位的神经细胞或分裂后的神经元能够部分重建神经环路和功能,NSCs作为一种移植细胞的来源,可以通过体外移植或体内激活,分化为神经元和胶质细胞,与已经存在的细胞结构整合到一起,从而达到中枢神经功能重建的目的。但是神经干细胞的移入不能从根本上解决AB清楚的问题,这个环节是NSCs解决不了的,现在认为只能临时改变症状,达不到根本的治疗目的。　　 研究发现骨髓及外周血中存在于细胞来源的内皮祖细胞(Endothelialprogenitore cells,EPCs,),在体外经诱导分化可表达内皮细胞特征性,在体内局部微环境作用下能发育为适宜局部生长的内皮细胞,具有修复、恢复损内皮细胞功能的潜能。研究发现AD病外周血中的内皮祖细胞含量较非AD病人减少;也发现,给予小鼠VEGF刺激后,有大量的内皮祖细胞大量动员入外周血,这可能是血管内皮的修复的机制。VEGF还可以促进内皮祖细胞的定向转化。因此,结合基因技术和干细胞作为载体的优势,将体外诱导的EPCs转入VEGF基因后,定向移植到AD模型鼠脑内海马区,促进该部位及邻近部位的血管重建以及内皮功能的改善,从而达到治疗AD病的目的。　　 EPCs易于从骨髓中获取,比神经干细胞的取材有很大优势,体外培养能保持未分化表型不断增殖,经诱导后才能分化为内皮细胞。基于此项研究,本研究采用体外分离培养实验大鼠骨髓源性内皮祖细胞。将构建的携带人VEGF165基因的pcDNA3.1质粒转染至EPCs,观察基因对EPCs的整合,表达的情况。采用APP/PS1双转基因模型,将转染人VEGF165基因的EPCs移植模型鼠脑内,观察小鼠行为学的变化,以及采用免疫组化统计Aβ含量的变化,以及血管的形成情况。　　 方法：　　 1.EPCs的分离纯化、培养、鉴定:采用密度梯度离心法从小鼠骨髓分离EPCs,培养,传代,进行CD34、CD133、Fnk-1进行免疫荧光染色,荧光倒置显微镜鉴定EPCs。　　 2.构建携带人VEGF165基因的真核表达质粒,构建含有hVEGF165基因的真核质粒载体,酶切、测序鉴定;对EPCs进行VEGF基因转染、扩增,ELISA方法分析EPCs中VEGF水平、免疫荧光方法检测VEGF蛋白在EPCs胞内表达。　　 3.对APP/PS1鼠进行基因鉴定,对血脑屏障的通透性采用EB的方法进行检测,对结构采用透射电镜进行观察。　　 4.将转染的VEGF基因的EPCs移植入APP/PS1小鼠脑内海马区。对其行为功能的检测,以及采用免疫组化法对AB的数量和血管的数量进行统计。　　 结果：　　 1.EPCs的分离纯化、培养、鉴定:密度梯度离心法分离的实验椒骨髓单个核细培养48小时后,镜下可见有细胞贴壁,形成集落；培养三天的细胞聚集成团,周围可见长梭形细胞迁出；培养至7-10天贴壁细胞逐渐增多,并呈现铺路石样改变。用CD34、CD133、Fnk-1对细胞染色后,通过荧光显微镜观察显示红蓝色,证实为EPCs。　　 2.重组质粒通过酶切和测序鉴定证实了hVEGF165定向插入到真核表达载体中。pcDNA3.1-hVEGF165可用于真核细胞的转染。　　 3.ELISA方法检测基因修饰EPCs各时相点均有VEGF表达。转染组与空质粒组、对照组间的比较差异显著(P＜0.01)。免疫荧光法检测EPCS胞内蛋白为VEGF蛋白。　　 4.APP/PS1基因鼠的鉴定显示在PCR条带,有608bp出现条带者即为APP/PS1转基因小鼠；EB含量检测可见APP/PS1转基因鼠于与非转基因鼠比差异显著p＜0.01；电竞所示,血管旋绕,扭曲,打圈,毛细血管内皮稀少,紧密连接松散,基底膜增厚,含空泡,发生透明变性和纤维化,血管周围的神经丛减少,管周细胞数减少。平滑肌细胞核型不规则,海马区内可见Aβ周围神经元溃变、肿胀,细胞内含有大量的脂褐素,神经突触稀松形态不一,微管小泡及线粒体堆积,胶质细胞胞浆肿胀。而非转基因小鼠海马的超微结构未见有此类的改变。　　 5.将转染VEGF基因的EPCs移植入大鼠的海马区后,动物在4,5,6天进行空间导航试验发现,与对照组比有差异p＜0.05；在5,6天,与对照组,EPCs组均有差异；Aβ免疫组化也发现,与对照组,EPCs组比较,三组之间均有差异P＜0.01；CD34组化染色表明,对照组、EPCs组,EPCs+VEGF组三组血管量增多,p＜0.01　　 结论：　　 1.小鼠骨髓提取单核细胞,进行内皮祖细胞的培养,方法简便,可操作性好,使用M199培养基+VEGF可诱导出足够数量的内皮祖细胞(三联鉴定为阳性细胞)。　　 2.重组质粒pcDNA3.1-hVEGF165转染到内皮祖细胞内可表达出VEGF蛋白,移植到鼠脑内,促进血管的形成。　　 3.APP/PS1双转基因鼠血脑屏障在其通透性上,以及结构上均与非转基因鼠不同,是进行AD病血管方面的研究的理想模型。　　 4.将VEGF+EPCs移植入鼠脑内,可以发现,老鼠的记忆能力增强,主要原因可能是通过新生血管的生成,促进Ap清除有关。