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低聚异麦芽糖(isomalto-oligosaccharides,IMO)是一种益生元,由于其促进益生菌生长、非发酵性、对人体无害、容易搭配到饮食等优点,在食品工业中需求量巨大。目前,工业上最常采用的是利用α-葡萄糖苷酶的高转苷活力催化合成IMO。低聚异麦芽糖的工业生产最先源于日本,利用黑曲霉α-葡萄糖苷酶将麦芽糖转化成IMO。黑曲霉α-葡萄糖苷酶(ANGL)具有底物浓度要求低、耐高温、转苷活力强的特点。毕赤酵母表面展示体系是一种通过生物细胞固定酶的真核表达体系。诱导表达后,展示外源蛋白的毕赤酵母重组菌株经过冷冻干燥或喷干,制备成为全细胞催化剂参与催化反应。本课题将通过毕赤酵母密码子优化的来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的α-葡萄糖苷酶编码基因全基因合成后,利用实验室保存的展示型毕赤酵母表达载体pKDCBGL-GCWn(12,19,21,49,61),成功将黑曲霉α-葡萄糖苷酶(ANGL)展示在毕赤酵母表面,测定发现其具有高转苷活力,优化其转苷反应条件,同时进行了全细胞催化剂在2 L反应釜中合成低聚异麦芽糖的重复利用性研究。本课题的研究内容和结果如下:(1)黑曲霉α-葡萄糖苷酶在毕赤酵母的表面展示:基于GPI型细胞壁蛋白Gcw12p、Gcw19p、Gcw21p、Gcw49p、Gcw61p构建了展示型表达载体pKANGL-GCWn(n=12,19,21,49,61),得到了展示型重组毕赤酵母菌株GS115/pKANGL-GCWn(n=12,19,21,49,61),生长曲线比对发现外源蛋白的展示没有对重组菌株的正常生长造成明显影响。ANGL水解酶活力及转苷活力的检测结果表明,ANGL经由5种毕赤酵母内源GPI型细胞壁蛋白均成功展示于酵母细胞表面,且具有较高生物活性。摇瓶发酵条件下诱导120h后测定水解酶活,发现以Gcw61p、Gcw19p作为锚定蛋白时,展示型ANGL转苷合成低聚异麦芽糖的酶活力较高,分别为:2.88 U/g、2.51U/g。同时,尝试构建多个锚定蛋白共表达重组毕赤酵母菌株,得到的重组菌株中,水解活力最高的是GS115/ANBGL-GCW(61+19),发酵120h后水解酶活5.16 U/g。(2)基于Pp-ANGL-GCW61的2-mL体系的转苷反应条件优化:将发酵120h的GS115/ANGL-GCW61酵母细胞冷冻干燥,制成全细胞催化剂Pp-ANGL-GCW61,以麦芽糖作为底物,对催化反应的pH、温度、底物浓度以及全细胞催化剂添加量进行优化。优化后的2 m L反应体系:62.5 mg/ml Pp-ANGL-GCW61,300 mg/ml麦芽糖,2 mL 0.04 M Britton Robinson缓冲液(pH 4.0),55?C,200 rpm。反应2 h,麦芽糖生成低聚异麦芽糖的转化率达到约45%。(3)基于Pp-ANGL-GCW61的2-mL、2-L反应体系重复利用:高速离心回收菌体,冷冻干燥后,全细胞催化剂重复利用3次。在2 L反应釜中,利用2-m L体系优化后的反应条件,进行2-L转苷合成低聚异麦芽糖反应体系的重复利用实验。2-m L、2-L体系的重复利用转化率曲线较为一致,随重复利用次数增加,达到最高转化率的时间有所延长,但三次重复利用的转化率曲线的差异不大,反应5 h时,重复利用第3次的麦芽糖转化率在30%左右。